 重組微生物及其用途
专利摘要:
本發明特別提供藉由使包含CO之基質進行微生物醱酵來產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體的方法；適用於此等方法之經基因改造之微生物；適於製備經基因改造之微生物之核酸；一種新穎醇去氫酶及其編碼核酸。 公开号:TW201309795A 申请号:TW101106425 申请日:2012-02-24 公开日:2013-03-01 发明作者:尚恩 丹尼斯 辛普森；麥可 蔻普其；風明 劉；陳銥婷 申请人:藍瑟科技紐西蘭有限公司； IPC主号:C12N15-00
专利说明:
重組微生物及其用途 本發明係關於藉由使包含一氧化碳之基質微生物醱酵來產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體的方法及適用於此等方法中之經基因改造之微生物。 已知諸如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)或拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)之一些微生物會在丁醇醱酵(ABE或IBE醱酵)期間產生丙酮或異丙醇作為主要副產物[George HA,Johnson JL,Moore WEC,Holdeman LV,Chen JS：Acetone,isopropanol,and butanol production by Clostridium beijerinckii(syn.Clostridium butylicum)and Clostridium aurantibutyricum.Appl Environ Microbiol 45：1160-1163]。然而，所有此等生物體皆依賴糖或澱粉基基質。諸如密切相關之微生物自養性產乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、揚氏梭菌(C.ljungdahlii)及羅氏梭菌(C.ragsdalei)之產乙酸生物體能夠利用含有CO或CO2/H2之氣體作為唯一能源及碳源化學自養生長且合成諸如乙酸鹽、乙醇或2,3-丁二醇之產物，但不合成丙酮或異丙醇[Munasinghe PC,Khanal SK：Biomass-derived syngas fermentation into biofuels：Opportunities and challenges.Bioresource Technol 2010,5013-22]。 近來，在一項關於羅氏梭菌(梭菌菌株P11)之研究中報導於100 L中試規模醱酵罐中自柳枝稷(switchgrass)源性合成氣產生異丙醇[Kundiyana DK,Huhnke RL,Wilkins MR：Syngas fermentation in a 100-L pilot scale fermentor：Design and process considerations.J Biosci Bioeng 2010,109：492-498]。然而，由同一實驗室進行之一項相關研究顯示此係歸因於所用合成氣中之污染，因為其穿過含有20%丙酮之洗滌混合物[Ramachandriya KD：Effect of biomass generated producer gas,methane and physical parameters on producer gas fermentations by Clostridium strain P11.Masters thesis,Oklahoma State University 2009]。作者亦注意到異丙醇之產生可能為丙酸而非丙酮還原之結果。由本發明之發明者用羅氏梭菌(梭菌菌株P11)以及自養性產乙醇梭菌及揚氏梭菌進行之實驗從未顯示會產生丙酮、異丙醇或丙酸。 許多適於產生諸如丙酮及異丙醇之化學產品之碳水化合物原料(feed stock)的成本受其作為人類食物或動物飼料之價值的影響，且載培產生澱粉或蔗糖之作物以用於此生產在所有地形上皆不具有經濟可持續性。因此，所關注的是開發將更低成本及/或更大量之碳資源轉化成諸如丙酮及異丙醇之適用化學產品的技術。 CO為諸如煤或油及油衍生產品之有機物質不完全燃燒之主要富含自由能的副產物。舉例而言，據報導澳大利亞之鋼鐵工業每年產生超過500,000公噸CO並將其釋放入大氣中。 本發明之一目標在於克服先前技術之一或多個缺點或至少提供公眾一種適用選擇。 本發明大體上提供尤其藉由微生物使包含CO之基質醱酵來產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體的方法；適用於此等方法中之經基因改造之微生物；適於製備經基因改造之微生物之核酸；及一種新穎醇去氫酶及其編碼核酸。 在第一態樣中，本發明提供一種能夠藉由使包含CO之基質醱酵來產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體的一氧化碳營養性產乙酸重組微生物。 在一個特定實施例中，微生物適於表現異丙醇生物合成路徑中之一或多種非天然存在於產生重組微生物之親本微生物中的酶。在另一實施例中，微生物適於過度表現異丙醇生物合成路徑中之一或多種天然存在於產生重組微生物之親本微生物中的酶。 在一個特定實施例中，微生物適於表現丙酮生物合成路徑中之一或多種非天然存在於產生重組微生物之親本微生物中的酶。在另一實施例中，微生物適於過度表現丙酮生物合成路徑中之一或多種天然存在於產生重組微生物之親本微生物中的酶。 在一個特定實施例中，微生物適於表現與丙酮轉化成異丙醇有關之一或多種非天然存在於產生重組微生物之親本微生物中的酶。在另一實施例中，微生物適於過度表現與丙酮轉化成異丙醇有關之一或多種天然存在於產生重組微生物之親本微生物中的酶。 在一個實施例中，親本微生物能夠使包含CO之基質醱酵以產生丙酮但不能將丙酮轉化成異丙醇且重組微生物適於表現與丙酮轉化成異丙醇有關之一或多種酶。 在另一實施例中，親本微生物能夠將丙酮轉化成異丙醇但不能使包含CO之基質醱酵以產生丙酮且重組微生物適於表現丙酮生物合成路徑中之一或多種酶。 在一個實施例中，親本微生物不能使包含CO之基質醱酵以產生丙酮及異丙醇且重組微生物適於表現丙酮生物合成路徑中之一或多種酶及與丙酮轉化成異丙醇有關之一或多種酶。 在一個實施例中，異丙醇及/或丙酮生物合成路徑中之一或多種酶係選自由以下組成之群：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)；乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA；EC 2.8.3.9)；乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)；乙醯乙酸去羧酶(Adc；EC 4.1.1.4)；α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD；EC4.1.1.74)；及其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個實施例中，乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)為源於丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)之乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶。 在一個實施例中，酶乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)及乙醯乙酸去羧酶(Adc)源於拜氏梭菌。 在一個實施例中，α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)為源於雷特氏乳球菌(Lactococcus lactis)之α-酮基異戊酸去羧酶。 在一個實施例中，與丙酮轉化成異丙醇有關之一或多種酶係選自由以下組成之群：醇去氫酶(Adh；EC 1.1.1.2)；醇去氫酶(Adh2；EC 1.1.1.1)及其功能等效變異體。 在一個實施例中，醇去氫酶(Adh)源於自養性產乙醇梭菌、揚氏梭菌及/或羅氏梭菌。在一個實施例中，醇去氫酶具有胺基酸序列SEQ_ID NO.1，或其為該胺基酸序列之功能等效變異體。在一個實施例中，功能等效變異體與SEQ_ID NO.1具有至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 在一個實施例中，醇去氫酶(Adh2)源於釀酒酵母(S.cerevisiae)。 在一個實施例中，微生物包含一或多種外源性核酸，其適於增加一或多種親本微生物天然核酸之表現且該一或多種核酸編碼本文先前提及之一或多種酶。 在一個實施例中，適於增加表現之一或多種外源性核酸為調控元件。在一個實施例中，調控元件為啟動子。在一個實施例中，啟動子為組成性啟動子。在一個實施例中，啟動子係選自包含伍德-永達爾(Wood-Ljungdahl)基因叢或磷酸轉乙醯酶/乙酸激酶操縱子啟動子之群。在一個實施例中，啟動子具有序列SEQ_ID No.22或SEQ ID no.77或為其功能等效變異體。 在一個實施例中，微生物包含一或多種編碼且適於表現本文先前提及之一或多種酶之外源性核酸。在一個實施例中，微生物包含一或多種編碼且適於表現至少兩種酶之外源性核酸。在其他實施例中，微生物包含一或多種編碼且適於表現3、4、5或6種酶之外源性核酸。 在一個特定實施例中，微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA；EC 2.8.3.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)及乙醯乙酸去羧酶(Adc；EC 4.1.1.4)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個特定實施例中，微生物包含一或多種編碼醇去氫酶(Adh；EC 1.1.1.2)或其功能等效變異體之外源性核酸。 在一個特定實施例中，微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA；EC 2.8.3.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)、乙醯乙酸去羧酶(Adc；EC 4.1.1.4)及醇去氫酶(Adh；EC 1.1.1.2)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個特定實施例中，微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD；EC4.1.1.74)及醇去氫酶(Adh2；EC 1.1.1.1)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個特定實施例中，微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA；EC 2.8.3.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)及α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD；EC4.1.1.74)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個特定實施例中，微生物包含一或多種編碼α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD；EC4.1.1.74)或其功能等效變異體之外源性核酸。 在一個特定實施例中，微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉換酶；CtfA；EC 2.8.3.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)、乙醯乙酸去羧酶(Adc；EC 4.1.1.4)及醇去氫酶(Adh2；EC 1.1.1.1)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在另一特定實施例中，微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA；EC 2.8.3.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)、乙醯乙酸去羧酶(Adc；EC 4.1.1.4)、α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD；EC4.1.1.74)及醇去氫酶(Adh2；EC 1.1.1.1)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個實施例中，編碼乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)之核酸包含序列SEQ_ID NO.18或其功能等效變異體。在一個實施例中，編碼乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)之核酸包含序列SEQ_ID NO.19或其功能等效變異體。在一個實施例中，編碼乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)之核酸包含序列SEQ_ID NO.20或其功能等效變異體。在一個實施例中，編碼乙醯乙酸去羧酶(Adc)之核酸包含序列SEQ_ID NO.21或其功能等效變異體。在一個實施例中，編碼α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)之核酸包含序列SEQ_ID NO.71或其功能等效變異體。在一個實施例中，編碼醇去氫酶(Adh)之核酸包含序列SEQ_ID NO.2、SEQ_ID NO.3或SEQ_ID NO.4或其任一種功能等效變異體。在一個實施例中，編碼醇去氫酶(Adh)之核酸之功能等效變異體與SEQ_ID NO.2、3或4具有至少約83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在一個實施例中，編碼醇去氫酶(Adh2)之核酸包含序列SEQ_ID NO.75或其功能等效變異體。 在一個實施例中，一或多種外源性核酸為編碼上文提及之呈任何組合之一或多種酶的核酸構築體或載體，在一個特定實施例中為質體。 在一個實施例中，外源性核酸為表現質體。在一個特定實施例中，表現質體具有核苷酸序列SEQ_ID No.46、48、83、84、95、98或101。 在一個實施例中，親本微生物係選自一氧化碳營養性產乙酸細菌之群，該細菌之群選自包含以下之群：自養性產乙醇梭菌、揚氏梭菌、羅氏梭菌、梭菌(Clostridium carboxidivorans)、黑暗梭菌(Clostridium drakei)、糞味梭菌(Clostridium scatologenes)、黏丁酸桿菌(Butyribacterium limosum)、甲基營養性丁酸桿菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏乙酸桿菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜鹼菌(Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、淤泥真桿菌(Eubacterium limosum)、嗜熱乙酸穆爾氏菌(Moorella thermoacetica)、嗜熱自養性穆爾氏菌(Moorella thermautotrophica)、芬氏產乙酸桿菌(Oxobacter pfennigii)及凱氏嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。 在一個實施例中，親本微生物為自養性產乙醇梭菌或揚氏梭菌。在一個特定實施例中，微生物為自養性產乙醇梭菌DSM23693。在另一特定實施例中，微生物為揚氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。 在一個實施例中，親本微生物缺乏編碼ThlA、CtfA、CtfB、Adc、KivD、Adh及Adh2之一或多種基因。在一個特定實施例中，親本微生物缺乏編碼Adh之基因。在另一特定實施例中，親本微生物缺乏編碼ThlA、CtfA、CtfB及Adc及KivD之基因中之每一者。 在第二態樣中，本發明提供一種具有胺基酸序列SEQ_ID NO.1或其任一種功能等效變異體之醇去氫酶(Adh)。 在一個特定實施例中，醇去氫酶(Adh)之功能等效變異體與SEQ_ID NO.1具有至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 在第三態樣中，本發明提供一種編碼具有SEQ_ID NO.1或其功能等效變異體之Adh的核酸。 在第四態樣中，本發明提供一種具有選自由以下組成之群之序列的核酸：SEQ_ID NO.2 SEQ_ID NO.3 SEQ_ID NO.4；及其任一種功能等效變異體。 在一個特定實施例中，SEQ_ID NO.2、3或4之功能等效變異體為與SEQ_ID NO.2、3或4具有至少約83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸。 在第五態樣中，本發明提供一種能夠與核酸SEQ_ID NO.2、3或4、其任一種互補核酸或其任一種功能等效變異體中至少一部分雜交的核酸。 在第六態樣中，本發明提供一種選自由以下組成之群之核酸：SEQ_ID NO.5；SEQ_ID NO.6；SEQ_ID NO.7；SEQ_ID NO.8；SEQ_ID NO.9；SEQ_ID NO.10；SEQ_ID NO.11；SEQ_ID NO.12；SEQ_ID NO.13；SEQ_ID NO.14；SEQ_ID NO.15；SEQ_ID NO.16；SEQ_ID NO.17；SEQ_ID NO.18；SEQ_ID NO.23；SEQ_ID NO.24；SEQ_ID NO.25；SEQ_ID NO.26；SEQ_ID NO.27；SEQ_ID NO.28；SEQ_ID NO.29；SEQ_ID NO.30；SEQ_ID NO.31；SEQ_ID NO.32；SEQ_ID NO.33；SEQ_ID NO.64；SEQ_ID NO.65；SEQ_ID NO.66；SEQ_ID NO.67；SEQ_ID NO.68；SEQ_ID NO.69；SEQ_ID NO.70；SEQ_ID NO.71；SEQ_ID NO.85；SEQ_ID NO.86；SEQ_ID NO.87；SEQ_ID NO.88；SEQ_ID NO.89；SEQ_ID NO.90；SEQ_ID NO.91；SEQ_ID NO.92；SEQ_ID NO.93；SEQ_ID NO.94；SEQ_ID NO.96；SEQ_ID NO.97；SEQ_ID NO.99；SEQ_ID NO.100。 在第七態樣中，本發明提供一種編碼一或多種當在微生物中表現時，會允許該微生物藉由使包含CO之基質醱酵來產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體之酶的核酸。 在一個實施例中，核酸編碼兩種或兩種以上當在微生物中表現時，會允許該微生物藉由使包含CO之基質醱酵來產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體的酶。 在一個實施例中，本發明之核酸編碼3、4、5或6種此等酶。 在一個實施例中，酶係選自乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)、乙醯乙酸去羧酶(Adc)、α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)、醇去氫酶(Adh2)、醇去氫酶(Adh)及其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個實施例中，核酸以任何順序包含編碼以下每一者之核酸序列：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)及乙醯乙酸去羧酶(Adc)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個實施例中，核酸包含編碼醇去氫酶(Adh)或其功能等效變異體之核酸序列。 在一個實施例中，核酸以任何順序包含編碼以下每一者之核酸序列：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)、乙醯乙酸去羧酶(Adc)及醇去氫酶(Adh)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個實施例中，核酸以任何順序包含編碼以下每一者之核酸序列：α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)、醇去氫酶(Adh2)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個實施例中，核酸以任何順序包含編碼以下每一者之核酸序列：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)、α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個實施例中，核酸以任何順序包含編碼以下每一者之核酸序列：α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個實施例中，核酸以任何順序包含編碼以下每一者之核酸序列：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)、乙醯乙酸去羧酶(Adc)、醇去氫酶(Adh2)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個實施例中，核酸以任何順序包含編碼以下每一者之核酸序列：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)、乙醯乙酸去羧酶(Adc)、α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)、醇去氫酶(Adh2)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個實施例中，核酸編碼具有序列SEQ_ID NO.42或其功能等效變異體之乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)。 在一個實施例中，核酸編碼具有序列SEQ_ID NO.43或其功能等效變異體之乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)。 在一個實施例中，核酸編碼具有序列SEQ_ID NO 43及SEQ_ID NO 44或其功能等效變異體之乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)。 在一個實施例中，核酸編碼具有序列SEQ ID No.45或其功能等效變異體之乙醯乙酸去羧酶(Adc)。 在一個實施例中，核酸編碼具有序列SEQ_ID NO 38及SEQ_ID NO 40之醇去氫酶(Adh)。在一個特定實施例中，核酸編碼具有序列SEQ_ID NO.1或其功能等效變異體之醇去氫酶(Adh)。在一個特定實施例中，醇去氫酶(Adh)之功能等效變異體與SEQ_ID NO.1具有至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 在一個實施例中，核酸編碼具有序列SEQ ID No.73或其功能等效變異體之α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)。 在一個實施例中，核酸編碼具有序列SEQ ID No.75或其功能等效變異體之醇去氫酶(Adh2)。 在一個實施例中，編碼乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)之核酸序列包含SEQ_ID NO.18或為其功能等效變異體。 在一個實施例中，編碼乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)之核酸序列包含SEQ_ID NO.19或為其功能等效變異體。 在一個實施例中，編碼乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)之核酸序列包含SEQ_ID NO.20或為其功能等效變異體。 在一個實施例中，編碼乙醯乙酸去羧酶(Adc)之核酸序列包含SEQ_ID NO.21或為其功能等效變異體。 在一個實施例中，編碼醇去氫酶(Adh)之核酸序列包含SEQ_ID NO.39或41。在一個特定實施例中，編碼醇去氫酶(Adh)之核酸序列包含SEQ_ID NO.2、SEQ_ID NO.3或SEQ_ID NO.4或為其任一種功能等效變異體。在一個實施例中，SEQ_ID NO.2、SEQ_ID NO.3或SEQ_ID NO.4之功能等效變異體與SEQ_ID NO.2、3或4具有至少約83%、84%、85%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 在一個實施例中，編碼α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)之核酸序列包含SEQ_ID NO.72或76或為其功能等效變異體。 在一個實施例中，編碼醇去氫酶(Adh2)之核酸序列包含SEQ_ID NO.74或77或為其功能等效變異體。 在一個實施例中，本發明之核酸另外包含啟動子。在一個實施例中，啟動子允許在其控制下組成性表現基因。在一特定實施例中，使用伍德-永達爾叢集啟動子。在另一特定實施例中，使用磷酸轉乙醯酶/乙酸激酶操縱子啟動子。在一個特定實施例中，啟動子來自自養性產乙醇梭菌。在一個特定實施例中，啟動子具有序列SEQ_ID NO.22、SEQ_ID NO.79或為其功能等效變異體。 在第八態樣中，本發明提供一種包含第七態樣之一或多種核酸之核酸構築體或載體。 在一個特定實施例中，核酸構築體或載體為表現構築體或載體。在一個特定實施例中，表現構築體或載體為質體。在一個特定實施例中，表現質體具有核苷酸序列SEQ_ID No.46、47、48、83、84、95、98或101。 在第九態樣中，本發明提供包含第七態樣之核酸或第八態樣之載體或構築體中之任何一或多種的宿主生物體。 在第十態樣中，本發明提供一種包含如在本發明之第八態樣中提及之表現構築體或載體以及甲基化構築體或載體之組合物。 較佳地，組合物能夠產生根據本發明之第一態樣之重組微生物。 在一個特定實施例中，表現構築體/載體及/或甲基化構築體/載體為質體。 在第十一態樣中，本發明提供一種產生本發明之重組微生物之方法，其包含：a.將(i)本發明之第八態樣之表現構築體/載體及(ii)包含甲基轉移酶基因之甲基化構築體/載體引入穿梭微生物中；b.表現該甲基轉移酶基因；c.自該穿梭微生物分離一或多種構築體/載體；及d.將至少該表現構築體/載體引入目標微生物中。 在一個實施例中，步驟B之兩種甲基轉移酶基因均組成性表現。在另一實施例中，誘導步驟B之甲基轉移酶基因之表現。 在一個實施例中，在步驟C中分離甲基化構築體/載體與表現構築體/載體兩者。在另一實施例中，在步驟C中僅分離表現構築體/載體。 在一個實施例中，僅將表現構築體/載體引入目標微生物中。在另一實施例中，表現構築體/載體與甲基化構築體/載體兩者均引入目標微生物中。 在一相關態樣中，本發明提供一種產生本發明之重組微生物之方法，其包含：a.藉由甲基轉移酶在活體外使本發明之第八態樣之表現構築體/載體甲基化；b.將表現構築體/載體引入目標微生物中。 在另一相關態樣中，本發明提供一種產生本發明之重組微生物之方法，其包含：a.將甲基轉移酶基因引入穿梭微生物之基因組中b.將本發明之第八態樣之表現構築體/載體引入該穿梭微生物中c.自該穿梭微生物分離一或多種構築體/載體；及d.將至少該表現構築體/載體引入目標微生物中。 在第十二態樣中，本發明提供一種藉由微生物醱酵來產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體的方法，其包含使用本發明之第一態樣之重組微生物使包含CO之基質醱酵。 在一個實施例中，方法包含以下步驟：(a)向含有本發明之第一態樣之一或多種微生物之培養物的生物反應器提供包含CO之基質；及(b)在該生物反應器中使該培養物厭氧醱酵以產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體。 在一個實施例中，方法包含以下步驟：(a)在使由於工業過程產生之含有CO之氣體釋放入大氣中之前捕捉該氣體；(b)由含有本發明之第一態樣之一或多種微生物的培養物使該含有CO之氣體厭氧醱酵以產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體。 在方法態樣之特定實施例中，微生物維持在水性培養基中。 在方法態樣之特定實施例中，基質之醱酵發生在生物反應器中。 較佳地，包含CO之基質為包含CO之氣體基質。在一個實施例中，基質包含工業廢氣。在某些實施例中，氣體為軋鋼廠廢氣或合成氣。 在一個實施例中，基質將通常含有較大比例之CO，諸如至少約20體積%至約100體積% CO、20體積%至70體積% CO、30體積%至60體積% CO、及40體積%至55體積% CO。在特定實施例中，基質包含約25體積%、或約30體積%、或約35體積%、或約40體積%、或約45體積%、或約50體積% CO、或約55體積% CO、或約60體積% CO。 在某些實施例中，方法另外包含自醱酵培養液回收丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體中之一或多者的步驟。 在第十三態樣中，當藉由第六態樣之方法產生時，本發明提供丙酮、異丙醇及丙酮及/或異丙醇之前驅體中之一或多者。 在另一態樣中，本發明提供一種產生本發明之第一態樣之微生物的方法，其包含用一或多種外源性核酸使一氧化碳營養性產乙酸親本微生物轉型以使該微生物能夠藉由使包含CO之基質醱酵來產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體，其中該親本微生物不能藉由使包含CO之基質醱酵來產生丙酮、異丙醇及/或其前驅體。 在一個特定實施例中，親本微生物用一或多種適於表現異丙醇生物合成路徑中之一或多種非天然存在於該親本微生物中之酶的外源性核酸轉型。在另一實施例中，親本微生物用一或多種適於過度表現異丙醇生物合成路徑中之一或多種天然存在於該親本微生物中之酶的核酸轉型。 在一個特定實施例中，親本微生物用一或多種適於表現丙酮生物合成路徑中之一或多種非天然存在於該親本微生物中之酶的外源性核酸轉型。在另一實施例中，親本微生物用一或多種適於過度表現丙酮生物合成路徑中之一或多種天然存在於該親本微生物中之酶的外源性核酸轉型。 在一個特定實施例中，親本微生物用一或多種適於表現與丙酮轉化成異丙醇有關之一或多種非天然存在於該親本微生物中之酶的核酸轉型。在另一實施例中，親本微生物用一或多種適於過度表現與丙酮轉化成異丙醇有關之一或多種天然存在於該親本微生物中之酶的核酸轉型。 在某些實施例中，一或多種酶係如本文先前所述。 在另一態樣中，本發明提供一種能夠產生丙酮且包含一或多種編碼一或多種適於將乙醯乙酸轉化成丙酮之酶之外源性核酸的重組微生物，其中該重組微生物源於能夠產生乙醯乳酸而非丙酮之親本微生物。在一個實施例中，一或多種酶包含KivD或其功能等效變異體。 在另一態樣中，本發明提供一種能夠產生丙酮且包含一或多種編碼酶thlA、ctfA、ctfB及kivD或其任何一或多者之功能等效變異體中之每一者之外源性核酸的重組微生物，其中該重組微生物源於不能產生乙醯乳酸、乙醯乙醯基-CoA及丙酮之親本微生物。 在另一態樣中，本發明提供一種能夠產生丙酮且包含一或多種編碼酶ctfA、ctfB及kivD或其任何一或多者之功能等效變異體中之每一者之外源性核酸的重組微生物，其中該重組微生物源於不能產生乙醯乳酸及丙酮之親本微生物。 本發明亦可概括地稱為在於本申請案之說明書中提及或指示之部分、要素及特徵係個別地或以該等部分、要素或特徵之兩者或兩者以上之任何或所有組合共同地加以提及或指示，且當在本文中提及在本發明所涉於之技術中具有已知等效值之特定整數時，此等已知等效值視為就如同個別地加以闡述一般併入本文中。 本發明之應考慮其所有新穎態樣之此等及其他態樣將根據在參考附圖之情況下僅以舉例方式提供之下列描述而變得顯而易知。 以下為概括地提供之對本發明之描述，包括其較佳實施例。本發明另外由在下文標題「實例」下提供之揭示內容闡明，該揭示內容提供支持本發明之實驗資料、本發明之各種態樣之特定實例，及執行本發明之手段。 先前尚未報導藉由使包含CO之基質微生物醱酵來產生丙酮及/或異丙醇。本發明之發明者目前已證明(尤其)經由基因改造，在能夠使用CO作為碳源及能源之一氧化碳營養性產乙酸細菌之物種中產生丙酮及異丙醇。發明者亦已驚人地能夠證明在含有CO之氣體存在下由密切相關之一氧化碳營養性產乙酸物種自養性產乙醇梭菌、揚氏梭菌及羅氏梭菌將丙酮天然酶促轉化成異丙醇。鑑別出一種新穎醇去氫酶，其顯示在用自養性產乙醇梭菌進行之正常醱酵期間以高量組成性表現且能夠以高濃度及高比率將丙酮轉化成異丙醇。發明者亦已發現在自養性產乙醇梭菌中驚人地對丙酮及異丙醇賦予活性之兩種基因。此等基因，即來自雷特氏乳球菌之α-酮酸去羧酶(Kivd)及來自釀酒酵母之醇去氫酶(Adh2)尚未報導會對丙酮或異丙醇或其任何前驅體賦予活性，而是報導其會將胺基酸前驅體轉化成分支鏈醇。使用若干不同基因及酶組合，發明者證明在自養性產乙醇梭菌中自CO產生丙酮及異丙醇。 因此，本發明提供例如藉由使包含CO之基質微生物醱酵來產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體的方法；適用於此等方法中之經基因改造之微生物；適於製備經基因改造之微生物之核酸；及新穎醇去氫酶及其編碼核酸。 如本文所提及，「醱酵培養液」為包含至少營養培養基及細菌細胞之培養基。 如本文所提及，穿梭微生物為其中表現甲基轉移酶且不同於目標微生物之微生物。 如本文所提及，目標微生物為其中表現包括在表現構築體/載體上之基因且不同於穿梭微生物之微生物。 術語「主要醱酵產物」意欲意謂以最高濃度及/或產率產生之一種醱酵產物。 術語「增加效率」、「增加之效率」及其類似術語在關於醱酵過程使用時包括(但不限於)增加以下一或多者：催化醱酵之微生物之生長速率、在升高之丙酮及/或異丙醇濃度下之生長速率及/或產物產生速率、消耗每體積基質所產生之所要產物之體積、所要產物之產生速率或產生含量，及產生之所要產物相較於醱酵之其他副產物的相對比例。 片語「包含一氧化碳之基質」及類似術語應瞭解為包括其中一氧化碳可為一或多種細菌菌株用於例如生長及/或醱酵之任何基質。 片語「包含一氧化碳之氣體基質」及類似片語及術語包括含有一定含量之一氧化碳之任何氣體。在某些實施例中，基質含有至少約20體積%至約100體積% CO、20體積%至70體積% CO、30體積%至60體積% CO及40體積%至55體積% CO。在特定實施例中，基質包含約25體積%、或約30體積%、或約35體積%、或約40體積%、或約45體積%、或約50體積% CO、或約55體積% CO、或約60體積% CO。 儘管基質並不必需含有任何氫氣，但H2之存在不應有害於根據本發明方法之產物形成。在特定實施例中，氫氣之存在導致醇產生之總效率改良。舉例而言，在特定實施例中，基質可包含約2：1或1：1或1：2比率之H2：CO。在一個實施例中，基質包含約30體積%或30體積%以下H2、20體積%或20體積%以下H2、約15體積%或15體積%以下H2或約10體積%或10體積%以下H2。在其他實施例中，基質流包含低濃度H2，例如小於5%、或小於4%、或小於3%、或小於2%或小於1%，或實質上不含氫氣。基質亦可含有例如一些CO2，諸如約1體積%至約80體積% CO2、或1體積%至約30體積% CO2。在一個實施例中，基質包含小於或等於約20體積% CO2。在特定實施例中，基質包含小於或等於約15體積% CO2、小於或等於約10體積% CO2、小於或等於約5體積% CO2或實質上不含CO2。 在隨後描述中，本發明之實施例係關於傳遞「含有CO之氣體基質」及使「含有CO之氣體基質」醱酵加以描述。然而，應瞭解氣體基質可以替代性形式提供。舉例而言，可提供溶解於液體中之含有CO之氣體基質。基本上，液體用含有一氧化碳之氣體飽和且接著添加彼液體至生物反應器中。此可使用標準方法達成。舉例而言，可使用微泡分散產生器(Hensirisak等人Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation；Applied Biochemistry and Biotechnology第101卷，第3期/2002年10月)。另外舉例而言，含有CO之氣體基質可吸附於固體支撐物上。此等替代性方法係藉由使用術語「含有CO之基質」及其類似術語加以涵蓋。 在本發明之特定實施例中，含有CO之氣體基質為工業廢氣(off gas/waste gas)。「工業廢氣」應廣泛認為包括由工業過程產生之包含CO之任何氣體且包括由於鐵金屬產品製造、非鐵產品製造、石油精煉過程、煤之氣化、生物質之氣化、電力產生、碳黑產生及焦炭製造所產生之氣體。在本文之別處可提供其他實例。 除非上下文另外要求，否則如本文所用之片語「醱酵」、「醱酵過程」或「醱酵反應」及其類似片語意欲涵蓋該過程之生長期與產物生物合成期兩者。如本文中進一步所述，在一些實施例中，生物反應器可包含第一生長反應器及第二醱酵反應器。因而，向醱酵反應中添加金屬或組合物應理解為包括向此等反應器之任一者或兩者中添加。 術語「生物反應器」包括由一或多個容器及/或塔或管路佈置組成之醱酵裝置，其包括連續攪拌槽反應器(CSTR)、固定化細胞反應器(ICR)、滴流床反應器(TBR)、氣泡柱、氣升醱酵罐、靜態混合器或適於氣體-液體接觸之其他容器或其他裝置。在一些實施例中，生物反應器可包含第一生長反應器及第二醱酵反應器。因而，當提及向生物反應器或醱酵反應中添加基質時，其應理解為包括適當時向此等反應器之任一者或兩者中添加。 「外源性核酸」為在其要引入之微生物之外部產生之核酸。外源性核酸可源於任何適當來源，包括(但不限於)其欲引入之微生物、不同於其欲引入之生物體之微生物的菌株或物種，或其可經人造或重組產生。在一個實施例中，外源性核酸表示天然存在於其欲引入之微生物內之核酸序列，且其經引入以增加特定基因之表現或過度表現特定基因(例如藉由增加序列(例如基因)之複本數或引入強力或組成性啟動子，以增加表現)。在另一實施例中，外源性核酸表示非天然存在於其欲引入之微生物內之核酸序列且允許表現非天然存在於微生物內之產物或增加微生物天然基因之表現(例如在引入諸如啟動子之調控元件之情況下)。外源性核酸可適於整合進入其欲引入之微生物之基因組中或保持染色體外狀態。 應瞭解，本發明可使用序列不同於本文明確例示之序列之核酸操作，其限制條件為其執行實質上相同功能。對於編碼蛋白質或肽之核酸序列，此意謂所編碼之蛋白質或肽具有實質上相同功能。對於表示啟動子序列之核酸序列，變異序列將能夠促進一或多種基因之表現。此等核酸在本文中可稱為「功能等效變異體」。舉例而言，核酸之功能等效變異體包括對偶基因變異體、基因片段、包括突變(缺失、插入、核苷酸取代及其類似突變)及/或多形現象之基因及其類似變異體。來自其他微生物之同源基因亦可視為本文明確例示之序列之功能等效變異體的實例。此等包括於諸如丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)及糖乙酸多丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)之物種中之同源基因，其詳情在諸如Genbank或NCBI之網站上公開可得。在基因源於釀酒酵母及乳酸乳球菌(Lactococcus lactics)之情況下，同源基因可見於例如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(例如NP_765765.1、EGG67352.1、ZP_04826144.1、ZP_04797999.1)、仙人掌桿菌(Bacillus cereus)(例如ZP_04273468.1、ZP_04317620.1)及蘇力菌(Bacillus thuringiensis)(例如YP_003664720.1)中。片語「功能等效變異體」亦應認為包括序列由於針對特定生物體進行密碼子優化而不同之核酸。本文核酸之「功能等效變異體」將較佳與所鑑別之核酸具有至少約70%、較佳約80%、更佳約85%、較佳約90%、較佳約95%或95%以上核酸序列一致性。 亦應瞭解本發明可使用序列不同於本文明確例示之胺基酸序列之多肽加以實施。此等變異體在本文中可稱為「功能等效變異體」。蛋白質或肽之功能等效變異體包括與所鑑別之蛋白質或肽共有至少40%、較佳50%、較佳60%、較佳70%、較佳75%、較佳80%、較佳85%、較佳90%、較佳95%或95%以上胺基酸一致性且與相關肽或蛋白質具有實質上相同功能的彼等蛋白質或肽。此等變異體在其範疇內包括蛋白質或肽之片段，其中該片段包含多肽之截短形式，其中缺失可為1至5、至10、至15、至20、至25個胺基酸，且可在多肽之任一末端處自殘基1延伸直至殘基25，且其中缺失可在區域內具有任何長度；或可在內部位置處。本文特定多肽之功能等效變異體亦應認為包括由例如如先前段落中例示之其他細菌物種中之同源基因表現的多肽。 如本文所用之「實質上相同功能」意欲意謂核酸或多肽能夠執行其作為其變異體之核酸或多肽之功能。舉例而言，本發明之酶之變異體將能夠催化與彼酶相同之反應。然而，不應認為意謂變異體與其作為其變異體之多肽或核酸具有相同活性程度。 可使用許多已知方法評估功能等效變異體是否與其作為其變異體之核酸或多肽具有實質上相同功能。然而，舉例而言，以下中概述之方法可用於評估酶活性：Wiesenborn等人[Thiolase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and Its Role in the Synthesis of Acids and Solvents.Appl Environ Microbiol.1988,54：2717-2722]；Wiesenborn等人[Coenzyme A transferase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and its role in the uptake of acids.Appl Environ Microbiol.1989,55：323-9.]；Peterson及Bennet[Purification of acetoacetate decarboxylase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and cloning of the acetoacetate decarboxylase gene in Escherichia coli.Appl Environ Microbiol.1990 56：3491-3498]；Ismail等人[Purification and characterization of a primary-secondary alcohol dehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii.J Bacteriol 1993,175：5097-5105]；de la Plaza等人[Biochemical and molecular characterization of a-ketoisovalerate decarboxylase,an enzyme involved in the formation of aldehydes from amino acids by Lactococcus lactis.FEMS Microbiol Lett.2004 238：367-374]或Khorkin等人[NADP-dependent bacterial alcohol dehydrogenases：crystal structure,cofactor-binding and cofactor specificity of the ADHs of Clostridium beijerinckii and Thermoanaerobacter brockii.J Mol Biol.1998,22：278(5)：967-981]。 「過度表現(Over-express)」、「過度表現(over expression)」及類似術語及片語在關於本發明使用時應廣泛認為包括一或多種蛋白質之表現相較於在相同條件下親本微生物之蛋白質之表現量的任何增加。不應認為意謂蛋白質以任何特定量表現。 「親本微生物」為用於產生本發明之重組微生物之微生物。親本微生物可為存在於自然界中之微生物(亦即野生型微生物)或先前已經修飾但不表現或過度表現本發明之一或多種標的酶之微生物。因此，本發明之重組微生物已經修飾以表現或過度表現一或多種在親本微生物中不表現或不過度表現之酶。 術語核酸「構築體」或「載體」及類似術語應廣泛認為包括適用作用以將遺傳物質轉移入細胞中之媒介物(vehicle)的任何核酸(包括DNA及RNA)。該等術語應認為包括質體、病毒(包括噬菌體)、黏質體及人工染色體。構築體或載體可包括一或多種調控元件、複製起點、多選殖位點及/或可選擇標記。在一個特定實施例中，構築體或載體適於允許表現由構築體或載體編碼之一或多種基因。核酸構築體或載體包括裸核酸以及與一或多種試劑一起調配以有助於傳遞至細胞中之核酸(例如脂質體結合核酸、其中含有核酸之生物體)。 「異丙醇生物合成路徑」為使CO或CO/H2代謝成異丙醇之酶促路徑，如例如於圖4中所概述。 「丙酮生物合成路徑」為使CO或CO/H2代謝成丙酮之酶促路徑，如例如於圖4中所概述。 丙酮之「前驅體」包括乙醯基-CoA、乙醯乙醯基-CoA、乙醯乙酸、乙醯基-磷酸及乙酸。 異丙醇之「前驅體」包括乙醯基-CoA、乙醯乙醯基-CoA、乙醯乙酸、丙酮、乙醯基-磷酸及乙酸。 提及「醇去氫酶」應認為包括能夠催化酮(諸如丙酮)轉化成二級醇(諸如異丙醇)(或反之亦然)之醇去氫酶。此等醇去氫酶包括二級醇去氫酶及一級醇去氫酶。「二級醇去氫酶」為可將酮(諸如丙酮)轉化成二級醇(諸如異丙醇)(或反之亦然)之醇去氫酶。「一級醇去氫酶」為可將醛轉化成一級醇(或反之亦然)之醇去氫酶；然而，許多一級醇去氫酶亦能夠催化酮轉化成二級醇或反之亦然。此等醇去氫酶亦可稱為「一級-二級醇去氫酶」。 如本文先前所論述，本發明提供一種能夠藉由使包含CO之基質醱酵來產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體之重組微生物。 在一個特定實施例中，微生物適於表現異丙醇生物合成路徑中之一或多種非天然存在於親本微生物中之酶。在另一實施例中，微生物適於過度表現異丙醇生物合成路徑中之一或多種天然存在於親本微生物中之酶。 在一個特定實施例中，微生物適於表現丙酮生物合成路徑中之一或多種非天然存在於親本微生物中之酶。在另一實施例中，微生物適於過度表現丙酮生物合成路徑中之一或多種天然存在於親本微生物中之酶。 在一個特定實施例中，微生物適於表現與丙酮轉化成異丙醇有關之一或多種非天然存在於親本微生物中之酶。在另一實施例中，微生物適於過度表現與丙酮轉化成異丙醇有關之一或多種天然存在於親本微生物中之酶。 在一個實施例中，親本微生物能夠使包含CO之基質醱酵以產生丙酮但不能將丙酮轉化成異丙醇且重組微生物適於表現與丙酮轉化成異丙醇有關之一或多種酶。 在另一實施例中，親本微生物能夠將丙酮轉化成異丙醇但不能使包含CO之基質醱酵以產生丙酮且重組微生物適於表現丙酮生物合成路徑中之一或多種酶。 在一個實施例中，親本微生物不能使包含CO之基質醱酵以產生丙酮及異丙醇且重組微生物適於表現丙酮生物合成路徑中之一或多種酶及與丙酮轉化成異丙醇有關之一或多種酶。 微生物可適於藉由許多重組方法表現或過度表現一或多種酶，該等方法包括例如增加微生物內之天然基因之表現(例如藉由引入更強力或組成性啟動子以驅動基因之表現)、藉由引入編碼且適於表現特定酶之外源性核酸來增加編碼該酶之基因之複本數、引入編碼且適於表現非天然存在於親本微生物內之酶之外源性核酸。 在某些實施例中，親本微生物可經轉型以提供使一或多種親本微生物天然基因之表現增加或過度表現一或多種親本微生物天然基因與引入一或多種非親本微生物天然基因的組合。舉例而言，一或多種編碼丙酮生物合成路徑中之酶之基因可為親本微生物天然基因但其可不包括一或多種編碼與丙酮轉化成異丙醇(或反之亦然)有關之酶之基因。微生物可經工程改造以過度表現一或多種編碼丙酮生物合成路徑中之酶之天然基因且引入編碼與丙酮轉化成異丙醇(或反之亦然)有關之酶之基因。類似地，微生物可經工程改造以過度表現丙酮生物合成路徑(及/或丙酮轉化成異丙醇)中之一或多種酶且引入一或多種編碼與相同路徑有關之酶之基因。熟習此項技術者將瞭解適用於本發明中之各種其他組合。 在一個實施例中，丙酮生物合成路徑中之一或多種酶係選自由以下組成之群：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)；乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA；EC 2.8.3.9)；乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)；乙醯乙酸去羧酶(Adc；EC 4.1.1.4)；α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD；EC4.1.1.74)；及其任何一或多者之功能等效變異體。 僅舉例而言，各肽之序列資訊提供於下文表6或表18中。 用於本發明之微生物中之酶可源於任何適當來源，包括不同細菌屬及物種或其他生物體。然而，在一個實施例中，乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)為源於丙酮丁醇梭菌之乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶。在一個實施例中，乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶具有下文表6中例示之胺基酸序列，或其為該胺基酸序列之功能等效變異體。 在一個實施例中，酶乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)及乙醯乙酸去羧酶(Adc)源於拜氏梭菌。 在一個實施例中，酶α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)為源於雷特氏乳球菌之α-酮基異戊酸去羧酶。 在一個實施例中，各酶具有下文表6或18中例示之胺基酸序列，或其為該胺基酸序列之功能等效變異體。 在一個實施例中，與丙酮轉化成異丙醇有關之一或多種酶係選自由以下組成之群：醇去氫酶(Adh；EC 1.1.1.2)；醇去氫酶(Adh2；EC 1.1.1.1)；及其功能等效變異體。 此外，用於本發明中之醇去氫酶可源於任何適當來源，包括不同細菌屬及物種(例如下文表13中例示之細菌物種)。然而，在一個特定實施例中，醇去氫酶(Adh)源於自養性產乙醇梭菌、揚氏梭菌及/或羅氏梭菌。在一個實施例中，醇去氫酶具有胺基酸序列SEQ_ID NO.1或其為該胺基酸序列之功能等效變異體。在一個實施例中，功能等效變異體與SEQ_ID NO.1具有至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 在一個實施例中，醇去氫酶(Adh2)源於釀酒酵母。 在一個實施例中，微生物包含一或多種外源性核酸，其適於增加一或多種親本微生物天然核酸之表現且該一或多種核酸編碼本文先前提及之一或多種酶。在一個實施例中，適於增加表現之一或多種外源性核酸為調控元件。在一個實施例中，調控元件為啟動子。在一個實施例中，啟動子為較佳在適當醱酵條件下具有高度活性之組成性啟動子。亦可使用誘導性啟動子。在較佳實施例中，啟動子係選自包含伍德-永達爾基因叢或磷酸轉乙醯酶/乙酸激酶操縱子啟動子之群。在一個實施例中，啟動子具有序列SEQ_ID No.22或77或為其功能等效變異體。在另一實施例中，可使用伍德-永達爾叢集啟動子(PWL)(SEQ ID No.56或57)、F1FO-ATPase操縱子之啟動子區(SEQ_ID NO 51、58或59)、Rnf複合操縱子啟動子區(SEQ_ID NO 52、60或61)或丙酮酸：鐵氧化還原蛋白(ferredoxin)氧化還原酶(SEQ_ID NO 53、62或63)啟動子區。熟習此項技術者應瞭解可在適當醱酵條件下引導表現、較佳高表現量之其他啟動子將有效作為所例示實施例之替代物。 在一個實施例中，微生物包含一或多種編碼且適於表現本文先前提及之一或多種酶之外源性核酸。在一個實施例中，微生物包含一或多種編碼且適於表現至少兩種酶之外源性核酸。在其他實施例中，微生物包含一或多種編碼且適於表現3、4、5或6種酶之外源性核酸。 在一個特定實施例中，微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA；EC 2.8.3.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)及乙醯乙酸去羧酶(Adc；EC 4.1.1.4)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個特定實施例中，微生物包含一或多種編碼醇去氫酶(Adh；EC 1.1.1.2)或其功能等效變異體之外源性核酸。 在一個特定實施例中，微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA；EC 2.8.3.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)、乙醯乙酸去羧酶(Adc；EC 4.1.1.4)及醇去氫酶(Adh；EC 1.1.1.2)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個特定實施例中，微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD；EC4.1.1.74)及醇去氫酶(Adh2；EC 1.1.1.1)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個特定實施例中，微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA；EC 2.8.3.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)及α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD；EC4.1.1.74)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個特定實施例中，微生物包含一或多種編碼α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD；EC4.1.1.74)或其任何一或多者之功能等效變異體之外源性核酸。 在一個特定實施例中，微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA；EC 2.8.3.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)、乙醯乙酸去羧酶(Adc；EC 4.1.1.4)及醇去氫酶(Adh2；EC 1.1.1.1)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在另一特定實施例中，微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA；EC 2.8.3.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)、乙醯乙酸去羧酶(Adc；EC 4.1.1.4)、α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD；EC4.1.1.74)及醇去氫酶(Adh2；EC 1.1.1.1)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個實施例中，乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)係由包含SEQ_ID NO.18或其功能等效變異體之核酸編碼。在一個實施例中，乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)係由包含SEQ_ID NO.19或其功能等效變異體之核酸編碼。在一個實施例中，乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)係由包含SEQ_ID NO.20或其功能等效變異體之核酸編碼。在一個實施例中，乙醯乙酸去羧酶(Adc)係由包含SEQ_ID NO.21或其功能等效變異體之核酸編碼。在一個實施例中，α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)係由包含SEQ_ID NO.72或76或其任一種功能等效變異體之核酸編碼。在一個實施例中，醇去氫酶(Adh)係由包含SEQ_ID NO.2、SEQ_ID NO.3或SEQ_ID NO.4或其任一種功能等效變異體之核酸編碼。在一個實施例中，醇去氫酶(Adh2)係由包含SEQ_ID NO.74或77或其任一種功能等效變異體之核酸編碼。 微生物可包含一或多種外源性核酸。當需要用兩種或兩種以上遺傳元件(諸如基因或調控元件(例如啟動子))轉型親本微生物時，其可含於一或多種外源性核酸上。 在一個實施例中，一或多種外源性核酸為編碼上文提及之呈任何組合之一或多種酶的核酸構築體或載體，在一個特定實施例中為質體。在一個特定實施例中，構築體編碼ThlA、CtfA、CtfB及Adc且視情況存在之Adh中之每一者。在另一實施例中，一或多種外源性核酸為編碼Adh且視情況存在之ThlA、CtfA、CtfB及/或Adc之核酸構築體或載體，在一個特定實施例中為質體。在一個特定實施例中，構築體編碼ThlA、CtfA、CtfB、Adc及Adh之全部。載體亦可包含編碼替代性酶組合之其他核酸組合，如根據在此文件中別處之描述顯而易知。在一個特定實施例中，載體以任何順序包含核酸序列SEQ_ID NO.19、20、21及22或其任一種功能等效變異體中之1、2、3或4者。在另一實施例中，載體以任何順序包含SEQ_ID_NO.2、3及/或4或其任一種功能等效變異體。在一個實施例中，載體以任何順序包含序列SEQ_ID NO.19、20、21及22或其任一種功能等效變異體及序列SEQ_ID_NO.2、3或4或其任一種功能等效變異體中之1、2、3或4者。 在另一實施例中，載體包含單獨或與由SEQ ID No.19、20、21、22、2、3及4表示之核酸中之一或多者組合之SEQ ID No.72、76、74、77中的一或多者。 外源性核酸可在親本微生物轉型後保持在染色體外或可整合入親本微生物之基因組中。因此，其可包括適於有助於整合(例如使同源重組並靶向整合入宿主基因組中之區域)或染色體外構築體表現及複製(例如複製起點、啟動子及其他調控元件或序列)之其他核苷酸序列。 在一個實施例中，編碼一或多種如上文提及之酶之外源性核酸將另外包含適於促進一或多種由外源性核酸編碼之酶之表現的啟動子。在一個實施例中，啟動子為較佳在適當醱酵條件下具有高度活性之組成性啟動子。亦可使用誘導性啟動子。在較佳實施例中，啟動子係選自包含伍德-永達爾基因叢及磷酸轉乙醯酶/乙酸激酶啟動子之群。在一個實施例中，啟動子具有序列SEQ_ID No.22、SEQ ID No.77或為其任一種功能等效變異體。在另一實施例中，可使用伍德-永達爾叢集啟動子(PWL)(SEQ ID No.56或57)、F1FO-ATPase操縱子之啟動子區(SEQ_ID NO 51、58或59)、Rnf複合操縱子啟動子區(SEQ_ID NO 52、60或61)、或丙酮酸：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(SEQ_ID NO 53、62或63)啟動子區。熟習此項技術者應瞭解可在適當醱酵條件下引導表現、較佳高表現量之其他啟動子將有效作為所例示實施例之替代物。 在一個實施例中，外源性核酸為表現質體。在一個特定實施例中，表現質體具有核苷酸序列SEQ_ID No.46、48、83、84、95、98或101。 在一個實施例中，親本微生物係選自一氧化碳營養性產乙酸細菌之群。在某些實施例中，微生物係選自包含以下之群：自養性產乙醇梭菌、揚氏梭菌、羅氏梭菌、梭菌(Clostridium carboxidivorans)、黑暗梭菌、糞味梭菌、柯氏梭菌(Clostridium coskatii)、黏丁酸桿菌、甲基營養性丁酸桿菌、伍氏乙酸桿菌、巴氏嗜鹼菌、Blautia producta、淤泥真桿菌、嗜熱乙酸穆爾氏菌、嗜熱自養性穆爾氏菌、芬氏產乙酸桿菌及凱氏嗜熱厭氧桿菌。 在一個特定實施例中，親本微生物係選自包含物種自養性產乙醇梭菌、揚氏梭菌及羅氏梭菌及相關分離株之產乙醇產乙酸梭菌(Clostridia)叢集。此等包括(但不限於)菌株自養性產乙醇梭菌JAI-1T(DSM10061)[Abrini J,Naveau H,Nyns E-J：Clostridium autoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide.Arch Microbiol 1994,4：345-351]、自養性產乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)[Simpson SD,Forster RL,Tran PT,Rowe MJ,Warner IL：Novel bacteria and methods thereof.國際專利2009,WO/2009/064200]、自養性產乙醇梭菌LBS1561(DSM23693)、揚氏梭菌PETCT(DSM13528=ATCC 55383)[Tanner RS,Miller LM,Yang D：Clostridium ljungdahlii sp.nov.,an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I.Int J Syst Bacteriol 1993,43：232-236]、揚氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)[Gaddy JL：Clostridium stain which produces acetic acid from waste gases.美國專利1997, 5,593,886]、揚氏梭菌C-01(ATCC 55988)[Gaddy JL,Clausen EC,Ko C-W：Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from the fermentation broth.美國專利2002, 6,368,819]、揚氏梭菌O-52(ATCC 55989)[Gaddy JL,Clausen EC,Ko C-W：Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from the fermentation broth.美國專利2002, 6,368,819]、羅氏梭菌P11T(ATCC BAA-622)[Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS：Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.國際專利2008,WO 2008/028055]、相關分離株，諸如「柯氏梭菌」[Zahn等人-Novel ethanologenic species Clostridium coskatii(美國專利申請案第US20110229947號)]、或突變菌株，諸如揚氏梭菌OTA-1(Tirado-Acevedo O.Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii.博士論文，North Carolina State University,2010)。此等菌株形成梭菌rRNA叢集I內之子叢集，且其16S rRNA基因之一致性超過99%且具有類似較低約30% GC含量。然而，DNA-DNA再締合及DNA指紋實驗顯示此等菌株屬於不同物種[Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS：Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.國際專利2008,WO 2008/028055]。 此叢集之所有物種皆具有類似形態及尺寸(對數生長細胞介於0.5-0.7×3-5 μm之間)，具有嗜中溫性(最佳生長溫度介於30-37℃之間)且為嚴格厭氧菌[Tanner RS,Miller LM,Yang D：Clostridium ljungdahlii sp.nov.,an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I.Int J Syst Bacteriol 1993,43：232-236；Abrini J,Naveau H,Nyns E-J：Clostridium autoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide.Arch Microbiol 1994,4：345-351；Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS：Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.國際專利2008,WO 2008/028055]。此外，其皆共有相同主要系統發生性狀，諸如相同pH值範圍(pH 4-7.5，最佳初始pH值為5.5-6)、利用含有CO之氣體以類似生長速率強力自養生長及以乙醇及乙酸作為主要醱酵終產物且在某些條件下形成少量2,3-丁二醇及乳酸之類似代謝概況。[Tanner RS,Miller LM,Yang D：Clostridium ljungdahlii sp.nov.,an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I.Int J Syst Bacteriol 1993,43：232-236；Abrini J,Naveau H,Nyns E-J：Clostridium autoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide.Arch Microbiol 1994,4：345-351；Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS：Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.國際專利2008,WO 2008/028055]。亦用所有三個物種觀測到吲哚產生。然而，物種之不同之處在於對各種糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡糖酸、檸檬酸)、胺基酸(例如精胺酸、組胺酸)或其他基質(例如甜菜鹼(betaine)、丁醇)之基質利用。此外，發現該等物種中之一些為某些維生素(例如硫胺素(thiamine)、生物素)之營養缺陷型(auxotroph)而其他物種並不如此。 在一個實施例中，親本菌株使用CO作為其唯一碳源及能源。 在一個實施例中，親本微生物為自養性產乙醇梭菌或揚氏梭菌。在一個特定實施例中，微生物為自養性產乙醇梭菌DSM23693。在另一特定實施例中，微生物為揚氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。 在一個實施例中，親本微生物缺乏編碼ThlA、CtfA、CtfB、Adc、KivD、Adh及Adh2之一或多種基因。在一個特定實施例中，親本微生物缺乏編碼Adh之基因。在另一特定實施例中，親本微生物缺乏編碼ThlA、CtfA、CtfB、Adc及KivD之基因中之每一者。 發明者已鑑別一種新穎Adh蛋白質。因此，本發明提供一種具有胺基酸序列SEQ_ID NO.1或其任一種功能等效變異體之醇去氫酶(Adh)。在一個特定實施例中，醇去氫酶(Adh)之功能等效變異體與SEQ_ID NO.1具有至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 此外，本發明提供一種編碼具有SEQ_ID NO.1或其功能等效變異體之Adh的核酸。考慮到本文提供之胺基酸序列及其中之遺傳密碼及簡併性，熟習此項技術者將易於瞭解此等核酸。然而，舉例而言，編碼具有SEQ_ID NO.1之Adh之核酸包括具有SEQ_ID NO.2、3或4或其功能等效變異體之核酸。在一個特定實施例中，SEQ_ID NO.2、3或4之功能等效變異體為與SEQ_ID NO.2、3或4具有至少約83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸。 本發明亦提供能夠與核酸SEQ_ID NO.2、3或4、其任一種互補核酸或其任一種功能等效變異體中之至少一部分雜交的核酸。此等核酸將較佳在嚴格雜交條件下雜交於具有SEQ_ID NO.2、3或4之核酸、互補於其任一種核酸或其任一種功能等效變異體。「嚴格雜交條件」意謂核酸能夠在標準雜交條件，諸如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA中所述條件下雜交於目標模板。應瞭解此等核酸之最小尺寸為能夠在既定核酸與其經設計以與之雜交之互補序列之間形成穩定雜交體的尺寸。因此，尺寸依賴於核酸組成及核酸與其互補序列之間的同源性百分比以及所利用之雜交條件(例如溫度及鹽濃度)。在一個實施例中，核酸長度為至少10個核苷酸、至少15個核苷酸、至少20個核苷酸、至少25個核苷酸或至少30個核苷酸。 發明者亦已鑑別適用作探針及引子之許多新穎核酸，如下文在實例章節中所詳述。舉例而言，SEQ_ID NO.5；SEQ_ID NO.6；SEQ_ID NO.7；SEQ_ID NO.8；SEQ_ID NO.9；SEQ_ID NO.10；SEQ_ID NO.11；SEQ_ID NO.12；SEQ_ID NO.13；SEQ_ID NO.14；SEQ_ID NO.15；SEQ_ID NO.16；SEQ_ID NO.17；SEQ_ID NO.18；SEQ_ID NO.23；SEQ_ID NO.24；SEQ_ID NO.25；SEQ_ID NO.26；SEQ_ID NO.27；SEQ_ID NO.28；SEQ_ID NO.29；SEQ_ID NO.30；SEQ_ID NO.31；SEQ_ID NO.32；SEQ_ID NO.33；SEQ_ID NO.64；SEQ_ID NO.65；SEQ_ID NO.66；SEQ_ID NO.67；SEQ_ID NO.68；SEQ_ID NO.69；SEQ_ID NO.70；SEQ_ID NO.71；SEQ_ID NO.85；SEQ_ID NO.86；SEQ_ID NO.87；SEQ_ID NO.88；SEQ_ID NO.89；SEQ_ID NO.90；SEQ_ID NO.91；SEQ_ID NO.92；SEQ_ID NO.93；SEQ_ID NO.94；SEQ_ID NO.96；SEQ_ID NO.97；SEQ_ID NO.99；SEQ_ID NO.100。 本發明亦提供適用於產生本發明之重組微生物之核酸及核酸構築體。 在一個實施例中，核酸包含編碼一或多種當在微生物中表現時，會允許該微生物藉由使包含CO之基質醱酵來產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體之酶的序列。在一個特定實施例中，本發明提供一種編碼兩種或兩種以上當在微生物中表現時，會允許該微生物藉由使包含CO之基質醱酵來產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體之酶的核酸。在一個實施例中，本發明之核酸編碼3、4、5或6種此等酶。 在一個特定實施例中，酶係選自乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)、乙醯乙酸去羧酶(Adc)、酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)、醇去氫酶(Adh)、醇去氫酶(Adh2)及其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個實施例中，本發明之核酸以任何順序包含編碼以下每一者之核酸序列：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)及乙醯乙酸去羧酶(Adc)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個實施例中，本發明之核酸以任何順序包含編碼以下每一者之核酸序列：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)、乙醯乙酸去羧酶(Adc)及醇去氫酶(Adh)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個實施例中，本發明之核酸以任何順序包含編碼以下每一者之核酸序列：α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)及醇去氫酶(Adh2)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個實施例中，本發明之核酸以任何順序包含編碼以下每一者之核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)及α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在一個實施例中，本發明之核酸包含編碼α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)或其功能等效變異體之核酸。 在一個實施例中，本發明之核酸以任何順序包含編碼以下每一者之核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)、乙醯乙酸去羧酶(Adc)及醇去氫酶(Adh2)或其任何一或多者之功能等效變異體。 在另一實施例中，本發明之核酸以任何順序包含編碼以下每一者之核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)、乙醯乙酸去羧酶(Adc)、α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)及醇去氫酶(Adh2)或其任何一或多者之功能等效變異體。 如本文之別處所述之編碼以上各酶的例示性胺基酸序列及核酸序列(參見尤其下表6及18中提供之實例)提供於GenBank中。然而，考慮到本文、GenBank及其他資料庫中含有之資訊及遺傳密碼，熟習此項技術者將易於瞭解編碼該等酶或其功能等效變異體之替代性核酸序列。 在一個實施例中，乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)具有序列Seq_ID No.42或其功能等效變異體。在一個實施例中，乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)具有序列Seq_ID No.43或其功能等效變異體。在一個實施例中，乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)具有序列Seq_ID No.44或其功能等效變異體。在一個實施例中，乙醯乙酸去羧酶(Adc)具有序列Seq_ID No.45或其功能等效變異體。在一個實施例中，α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)具有序列Seq_ID No.73或其功能等效變異體。在一個實施例中，醇去氫酶(Adh)具有序列SEQ_ID NO 38及SEQ_ID NO 40。在一個特定實施例中，醇去氫酶(Adh)具有序列SEQ_ID NO.1或其功能等效變異體。在一個特定實施例中，醇去氫酶(Adh)之功能等效變異體與SEQ_ID NO.1具有至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在一個實施例中，醇去氫酶(Adh2)具有序列SEQ_ID NO 75或其功能等效變異體。 在一個實施例中，編碼乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)之核酸序列包含SEQ_ID NO.18或為其功能等效變異體。在一個實施例中，編碼乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)之核酸序列包含SEQ_ID NO.19或為其功能等效變異體。在一個實施例中，編碼乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)之核酸序列包含SEQ_ID NO.20或為其功能等效變異體。在一個實施例中，編碼乙醯乙酸去羧酶(Adc)之核酸序列包含SEQ_ID NO.21或為其功能等效變異體。在一個實施例中，編碼α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)之核酸序列包含SEQ_ID NO.72或76或為其任一種功能等效變異體。在一個實施例中，編碼醇去氫酶(Adh2)之核酸序列包含SEQ_ID NO.74或77或為其功能等效變異體。在一個實施例中，編碼醇去氫酶(Adh)之核酸序列包含Seq_ID No.39或SEQ_ID NO 41或為其任一種功能等效變異體。在一個特定實施例中，編碼醇去氫酶(Adh)之核酸序列包含SEQ_ID NO.2、SEQ_ID NO.3或SEQ_ID NO.4或為其任一種功能等效變異體。在一個實施例中，SEQ_ID NO.2、SEQ_ID NO.3或SEQ_ID NO.4之功能等效變異體與SEQ_ID NO.2、3或4具有至少約83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 在一個實施例中，本發明之核酸將另外包含啟動子。在一個實施例中，啟動子允許在其控制下組成性表現基因。然而，亦可採用誘導性啟動子。熟習此項技術者將易於瞭解適用於本發明中之啟動子。較佳地，啟動子可在適當醱酵條件下引導量表現高。在一特定實施例中，使用伍德-永達爾叢集啟動子。在另一實施例中，使用磷酸轉乙醯酶/乙酸激酶啟動子。在另一實施例中，使用丙酮酸：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶啟動子、Rnf複合操縱子啟動子或ATP合成酶操縱子啟動子。在一個特定實施例中，啟動子來自自養性產乙醇梭菌。在一個特定實施例中，啟動子具有序列SEQ_ID NO.22、SEQ ID No 79或為其任一種功能等效變異體。在其他實施例中，啟動子具有序列SEQ ID No.56、57、51、58、59、52、60、61、53、62或63或為其任一種功能等效變異體。 本發明之核酸可在親本微生物轉型後保持在染色體外或可適於整合入微生物之基因組中。因此，本發明之核酸可包括適於有助於整合(例如使同源重組並靶向整合入宿主基因組中之區域)或染色體外構築體穩定表現及複製(例如複製起點、啟動子及其他調控序列)之其他核苷酸序列。 在一個實施例中，核酸為核酸構築體或載體。在一個特定實施例中，核酸構築體或載體為表現構築體或載體，然而，本發明涵蓋其他構築體及載體(諸如用於選殖者)。在一個特定實施例中，表現構築體或載體為質體。在一個特定實施例中，表現質體具有核苷酸序列SEQ_ID No.46、48、83、84、95、98或101。 應瞭解除啟動子之外，本發明之表現構築體/載體亦可含有許多調控元件以及必要時適於表現其他蛋白質之其他基因。在一個實施例中，表現構築體/載體包括一個啟動子。在另一實施例中，表現構築體/載體包括兩個或兩個以上啟動子。在一個特定實施例中，表現構築體/載體針對欲表現之各基因皆包括一個啟動子。在一個實施例中，表現構築體/載體包括一或多個核糖體結合位點，較佳針對欲表現之各基因皆包括一個核糖體結合位點。 熟習此項技術者應瞭解本文所述之核酸序列及構築體/載體序列可含有標準連接子核苷酸，諸如為核糖體結合位點及/或限制性位點所需者。此等連接子序列不應解釋為為必需的且不提供對所規定序列之限制。 可使用此項技術中之許多標準技術構築核酸及核酸構築體，包括本發明之表現構築體/載體。舉例而言，可使用化學合成或重組技術。此等技術例如描述於Sambrook等人(Molecular Cloning：A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)中。其他例示性技術描述於下文實例章節中。基本上，個別基因及調控元件將可操作地彼此連接以使基因可經表現而形成所要蛋白質。適用於本發明中之載體將為一般技術者所瞭解。然而，舉例而言，下列載體可為適合的：pMTL80000載體、pIMP1、pJIR750及下文實例章節中例示之質體。 應瞭解本發明之核酸可呈任何適當形式，包括RNA、DNA或cDNA。 本發明亦提供包含本文所述之任何一或多種核酸之宿主生物體，特定言之微生物，且包括病毒、細菌及酵母。 一或多種外源性核酸可以裸核酸形式傳遞至親本微生物中或可與一或多種試劑一起調配以有助於轉型過程(例如脂質體結合核酸、其中含有核酸之生物體)。一或多種核酸可為DNA、RNA或適當時其組合。限制性抑制劑可用於某些實施例中；參見例如Murray,N.E.等人(2000)Microbial.Molec.Biol.Rev.64,412。 本發明之微生物可使用此項技術中已知之用於產生重組微生物之許多技術自親本微生物及一或多種外源性核酸製備。僅舉例而言，轉型(包括轉導或轉染)可藉由電穿孔、超音波處理、聚乙二醇介導之轉型、化學或天然勝任性處理或結合來達成。適合轉型技術例如描述於Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T：Molecular Cloning：A laboratory Manual,Cold Spring Harbour Labrotary Press,Cold Spring Harbour,1989中。 在某些實施例中，歸因於在欲轉型之微生物中具有活性之限制性系統，必須使欲引入微生物中之核酸甲基化。此可使用多種技術，包括以下所述且在下文實例章節中進一步例示者來進行。 舉例而言，在一個實施例中，本發明之重組微生物係藉由包含下列步驟之方法產生：將(i)如本文所述之表現構築體/載體及(ii)包含甲基轉移酶基因之甲基化構築體/載體引入穿梭微生物中；表現該甲基轉移酶基因；自該穿梭微生物分離一或多種構築體/載體；及將該一或多種構築體/載體引入目標微生物中。 在一個實施例中，步驟B之甲基轉移酶基因係組成性表現。在另一實施例中，誘導步驟B之甲基轉移酶基因之表現。 穿梭微生物為有助於組成表現構築體/載體之核酸序列之甲基化的微生物，較佳為限制性陰性微生物。在一特定實施例中，穿梭微生物為限制性陰性大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillus subtillis)或雷特氏乳球菌。 甲基化構築體/載體包含編碼甲基轉移酶之核酸序列。 一旦表現構築體/載體及甲基化構築體/載體引入穿梭微生物中，就誘導存在於甲基化構築體/載體上之甲基轉移酶基因。誘導可藉由任何適合啟動子系統達成，但在本發明之一個特定實施例中，甲基化構築體/載體包含誘導性lac啟動子(較佳由SEQ_ID NO 50編碼)且係藉由添加乳糖或其類似物，更佳異丙基-β-D-硫代-半乳糖苷(IPTG)加以誘導。其他適合啟動子包括ara、tet或T7系統。在本發明之另一實施例中，甲基化構築體/載體啟動子為組成性啟動子。 在一特定實施例中，甲基化構築體/載體具有對穿梭微生物之身分具有特異性之複製起點以使存在於甲基化構築體/載體上之任何基因皆在穿梭微生物中表現。較佳地，表現構築體/載體具有對目標微生物之身分具有特異性之複製起點以使存在於表現構築體/載體上之任何基因皆在目標微生物中表現。 甲基轉移酶之表現導致存在於表現構築體/載體上之基因甲基化。表現構築體/載體可接著根據許多已知方法中之任一者與穿梭微生物分離。僅舉例而言，下文所述之實例章節中所述之方法可用於分離表現構築體/載體。 在一個特定實施例中，同時分離構築體/載體。 表現構築體/載體可使用許多已知方法引入目標微生物中。然而，舉例而言，可使用下文實例章節中所述之方法。因為表現構築體/載體經甲基化，所以存在於表現構築體/載體上之核酸序列能夠併入目標微生物中且成功表現。 設想甲基轉移酶基因可引入穿梭微生物中且過度表現。因此，在一個實施例中，所得甲基轉移酶可使用已知方法收集且在活體外用於使表現質體甲基化。表現構築體/載體可接著引入目標微生物中以達成表現。在另一實施例中，甲基轉移酶基因引入穿梭微生物之基因組中，隨後將表現構築體/載體引入穿梭微生物中，自穿梭微生物分離一或多種構築體/載體且接著將表現構築體/載體引入目標微生物中。 設想如上定義之表現構築體/載體與甲基化構築體/載體可組合以提供相關組合物(composition of matter)。該種組合物在避免限制性障壁機制以產生本發明之重組微生物方面具有特定效用。 在一個特定實施例中，表現構築體/載體及/或甲基化構築體/載體為質體。 一般技術者將瞭解適用於產生本發明之微生物之許多適合甲基轉移酶。然而，舉例而言，可使用枯草桿菌噬菌體ΦT1甲基轉移酶及下文實例中所述之甲基轉移酶。在一個實施例中，甲基轉移酶具有胺基酸序列SEQ_ID No.34或為其功能等效變異體。考慮到所要甲基轉移酶之序列及遺傳密碼，將易於瞭解編碼適合甲基轉移酶之核酸。在一個實施例中，編碼甲基轉移酶之核酸係如下文實例中所述(例如具有SEQ_ID NO 35之核酸，或為其功能等效變異體)。 許多適於允許表現甲基轉移酶基因之構築體/載體可用於產生甲基化構築體/載體。然而，舉例而言，可使用下文實例章節中所述之質體。在一個特定實施例中，質體具有序列SEQ_ID NO.49。 本發明提供一種藉由微生物醱酵來產生一或多種所需產物(丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體)之方法，其包含使用本發明之重組微生物使包含CO之基質醱酵。本發明方法可用於降低工業過程之總大氣碳排放。 較佳地，醱酵包含使用本發明之重組微生物在生物反應器中使基質厭氧醱酵以產生一或多種產物之步驟。 在一個實施例中，方法包含以下步驟：(a)向含有本發明之一或多種微生物之培養物的生物反應器提供包含CO之基質；及(b)在該生物反應器中使該培養物厭氧醱酵以產生一或多種產物。 在一個實施例中，方法包含以下步驟：(a)在使由於工業過程產生之含有CO之氣體釋放入大氣中之前捕捉該氣體；(b)藉由含有本發明之一或多種微生物之培養物使該含有CO之氣體厭氧醱酵以產生一或多種產物。 在本發明之一實施例中，由微生物醱酵之氣體基質為含有CO之氣體基質。氣體基質可為作為工業過程之副產物獲得或來自一些其他來源，諸如來自汽車排放廢氣(automobile exhaust fumes)之含有CO之廢氣。在某些實施例中，工業過程係選自由以下組成之群：鐵金屬產品製造(諸如軋鋼廠)、非鐵產品製造、石油精煉過程、煤之氣化、電力產生、碳黑產生、氨產生、甲醇產生及焦炭製造。在此等實施例中，含有CO之氣體可在其排放入大氣中之前使用任何便利方法自工業過程捕捉。CO可為合成氣(包含一氧化碳及氫氣之氣體)之組分。自工業過程產生之CO通常經燃燒去除以產生CO2且因此本發明在降低CO2溫室氣體排放及產生用作生物燃料之丁醇方面具有特定效用。視含有CO之氣體基質之組成而定，亦可能需要在將其引入去醱酵之前對其進行處理以移除任何不需要的雜質，諸如塵粒。舉例而言，可使用已知方法過濾或洗滌氣體基質。 應瞭解對於細菌生長及將CO轉化成一或多種產物，除含有CO之基質氣體之外，亦將需要將適合液體營養培養基饋入生物反應器中。基質及培養基可以連續、批式或批式饋料方式饋入生物反應器中。營養培養基將含有足以允許所用微生物生長之維生素及礦物質。適於使用CO進行醱酵以產生丁醇之厭氧培養基在此項技術中為已知的。舉例而言，適合培養基描述於Biebel(2001)中。在本發明之一個實施例中，培養基係如下文實例章節中所述。 該醱酵法應需在適於CO醱酵產生一或多種產物之條件下進行。應考慮之反應條件包括壓力、溫度、氣流速率、液流速率、培養基pH值、培養基氧化還原電位、攪拌速率(若使用連續攪拌槽反應器)、接種物量、用於確保液相中之CO不會具有限制性之最高氣體基質濃度及用於避免產物抑制性之最高產物濃度。 此外，常需要增加基質流之CO濃度(或氣體基質中之CO分壓)且因此提高以CO為基質之醱酵反應之效率。在高壓下操作時，可以顯著提高CO從氣相轉移至液相之速率，微生物可吸收液相中之CO作為碳源，產生一或多種產物。此又意謂當生物反應器維持在高壓而非大氣壓力下時，可縮短滯留時間(其定義為生物反應器中之液體體積除以輸入氣流速率)。最佳反應條件將部分視所採用本發明特定微生物而定。然而，一般而言，在高於環境壓力之壓力下進行醱酵較佳。此外，因為指定之CO轉化為一或多種產物之轉化率部分隨基質滯留時間而變化，且達到所需滯留時間進而表示生物反應器之所需體積，所以使用加壓系統可極大幅降低所需生物反應器體積，及因此降低醱酵設備之投資成本。根據美國專利第5,593,886號中提供之實例，反應器體積可依線性比例降低，以增加反應器操作壓力，亦即在10個大氣壓下操作之生物反應器所需之體積僅為在1個大氣壓下操作之生物反應器體積的十分之一。 舉例而言，已描述在高壓下進行氣體醱酵產生乙醇之益處。舉例而言，WO 02/08438描述在30 psig及75 psig之壓力下進行之氣體產生乙醇之醱酵反應，分別產生每天150 g/l及每天369 g/l之乙醇產生量。然而，發現使用類似培養基與輸入氣體組合物在大氣壓力下進行之例示性醱酵每天每公升產生之乙醇減少10至20倍。 亦需要使引入含有CO之氣體基質之速率可以確保液相中CO之濃度不會具有限制性。此係因為CO限制條件之後果可能為乙醇產物被培養物消耗掉。 用於饋入醱酵反應之氣流之組成可顯著影響彼反應之效率及/或成本。舉例而言，O2可降低厭氧醱酵過程之效率。在醱酵之前或之後處理醱酵過程之各階段中之不想要或不必要氣體可增加此等階段之負擔(例如當氣流在進入生物反應器之前經壓縮時，可能使用不必要之能量來壓縮醱酵中不需要之氣體)。因此，可能需要處理基質流，特定言之源於工業來源之基質流以移除不想要的組分且增加所需組分之濃度。 在某些實施例中，本發明之細菌之培養物維持在水性培養基中。較佳地，水性培養基為基本厭氧微生物生長培養基。適合培養基在此項技術中為已知的且例如描述於美國專利第5,173,429號及第5,593,886號及WO 02/08438中，且如下文實例章節中所述。 丙酮、異丙醇或含有丙酮及/或異丙醇及/或一或多種其他產物之混合流可藉由此項技術中已知之方法自醱酵培養液回收，該等方法諸如分餾或蒸發、滲透蒸發、氣提及萃取醱酵，包括例如液-液萃取。 在本發明之某些較佳實施例中，藉由連續自生物反應器移除一部分培養液、自培養液分離微生物細胞(宜藉由過濾分離)及自培養液回收一或多種產物來自醱酵培養液回收一或多種產物。醇可宜例如藉由蒸餾加以回收。丙酮可例如藉由蒸餾加以回收。產生之任何酸皆可例如藉由吸附於活性木炭上加以回收。分離之微生物細胞較佳返回至醱酵生物反應器中。在任何醇及酸已經移除之後剩餘之不含細胞之滲透物亦較佳返回至醱酵生物反應器中。可添加其他養分(諸如B族維生素)至不含細胞之滲透物中以補充營養培養基，隨後使其返回至生物反應器中。 此外，若如上所述調整培養液之pH值以增強乙酸吸附至活性木炭，則pH值應再調整至類似於醱酵生物反應器中之培養液的pH值，隨後返回至生物反應器中。實例： 現將參考下列非限制性實例更詳細描述本發明。 微生物及生長條件 伍氏乙酸桿菌DSM1030、乙酸梭菌(Clostridium aceticum)DSM1496、自養性產乙醇梭菌DSM23693、梭菌(梭菌(C.carboxidivorans))DSM15243及揚氏梭菌DSM13528來源於DSMZ(德國微生物及細胞培養物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)，Inhoffenstraße 7 B,38124 Braunschweig,Germany)。自養性產乙醇梭菌DSM23693為自養性產乙醇梭菌DSM10061之衍生物。 羅氏梭菌ATCC BAA-622來源於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，Manassas,VA 20108,USA)。 丙酮丁醇梭菌ATCC824、拜氏梭菌NRRL-B593及拜氏梭菌NCIMB8052自David Jones教授(University of Otago)獲得且亦可分別在寄存編號ATCC824/DSM792、DSM6423及ATCC51743下自公開菌株保藏中心DSMZ及ATCC獲得。 大腸桿菌DH5α-T1R來源於Invitrogen(Carlsbad,CA 92008,USA)且大腸桿菌XL1-Blue MRF' Kan及ABLE K來源於Stratagene(Santa Clara,CA 95051-7201,USA)。大腸桿菌JW3350-2來源於大腸桿菌遺傳儲備中心(Coli Genetic Stock Center，CGSC)(New Haven,CT 06520-8103)。 大腸桿菌在好氧條件與厭氧條件兩者下培養，而所有其他菌株皆在果糖存在下(異養生長)或在30 psi含有CO之軋鋼廠氣體(自Glenbrook,NZ之New Zealand Steel地點收集；組成：44% CO、32% N2、22% CO2、2% H2)存在於頂空中之情況下(自養生長)在血清瓶中嚴格厭氧生長於50 ml體積液體培養基中。 根據表2-4中提供之配方使用標準厭氧技術製備培養基[Hungate RE：A roll tube method for cultivation of strict anaerobes,Norris JR及Ribbons DW(編)，Methods in Microbiology，第3B卷Academic Press,New York,1969：117-132；Wolfe RS：Microbial formation of methane.Adv Microb Physiol 1971,6：107-146]。對於固體培養基，添加1.2%細菌瓊脂(Bacto agar)(BD,Frankton Lakes,NJ 07417,USA)。 除伍氏乙酸桿菌、乙酸梭菌及羅氏梭菌在30℃下生長之外，所有菌株皆在37℃下生長。 表2：PETC培養基(伍氏乙酸桿菌，pH 8.2；乙酸梭菌，pH 7.4；自養性產乙醇梭菌、梭菌(梭菌(C.carboxidivorans))、揚氏梭菌及羅氏梭菌，pH 5.6) 如下所述在37℃及含有CO之軋鋼廠氣體作為唯一能源及碳源下在1.5 L生物反應器中用自養性產乙醇梭菌DSM23693進行醱酵。使用經製備以用於培養物生長之合成培養基，每公升含有：MgCl、CaCl2(0.5 mM)、KCl(2 mM)、H3PO4(5 mM)、Fe(100 μM)、Ni、Zn(5 μM)、Mn、B、W、Mo、Se(2 μM)。培養基轉移入生物反應器中且在121℃下高壓滅菌45分鐘。在高壓滅菌之後，培養基補充有硫胺素、泛酸鹽(0.05 mg)、生物素(0.02 mg)且用3 mM半胱胺酸鹽酸鹽還原。為達成厭氧性，反應器容器用經過0.2 μm過濾器之氮氣充氣。在接種之前，氣體切換成含有CO之軋鋼廠氣體，連續饋入反應器中。氣流初始設定在80 ml/min下，在指數中期期間增加至200 ml/min，而攪拌自200 rpm增加至350。Na2S在0.25 ml/h下投入生物反應器中。一旦OD600達到0.5，生物反應器即切換成在1.0 ml/min之速率(稀釋率0.96 d-1)下之連續模式。獲取培養基樣品以量測生物質量及代謝物且定期對流入及流出氣體進行頂空分析。 分析代謝物 使用配備有在35℃下操作之RID(折射率偵測器)及保持在60℃下之Alltech IOA-2000有機酸管柱(150×6.5 mm，粒度5 μm)之Agilent 1100系列HPLC系統對丙酮、異丙醇及其他代謝物進行HPLC分析。以流速0.7 ml/min使用略微酸化之水(0.005 M H2SO4)作為移動相。為移除蛋白質及其他細胞殘餘物，混合400 μl樣品與100 μl 2%(w/v)5-磺基水楊酸且在14,000×g下離心3分鐘以分離沈澱殘餘物。接著將10 μl上清液注射入HPLC中以進行分析。 使用配備有Supelco PDMS 100 1 cm纖維、Alltech EC-1000(30 m×0.25 mm×0.25 μm)管柱及火焰離子化偵測器(FID)之Agilent 6890N頂空GC對丙酮、異丙醇及其他代謝物進行GC分析。5 ml樣品轉移入亨蓋特管(Hungate tube)中，於水浴中加熱至40℃且暴露於纖維持續精確5分鐘。注射器保持在250℃下且以恆定流量1 ml/min之氦氣用作載氣。烘箱程式為40℃ 5分鐘，隨後每分鐘增加10℃直至200℃。接著以50℃/min之速率進一步增加溫度至220℃，隨後保持此溫度5分鐘，接著以50℃/min之速率使溫度降低至40℃並最終保持1分鐘。FID以40 ml/min氫氣、450 ml/min空氣及15 ml/min氮氣作為補充氣(make up gas)保持在250℃下。 頂空分析 在安裝有兩個通道之Varian CP-4900微型GC上進行量測。通道1為在70℃、200 kPa氬氣及反衝時間4.2 s下操作之10 m分子篩管柱，而通道2為在90℃、150 kPa氦氣及不進行反衝下操作之10 m PPQ管柱。兩個通道之注射器溫度均為70℃。操作時間設定成120 s，但所有相關峰皆將通常在100 s之前溶離。 基因改造自養性產乙醇梭菌及揚氏梭菌以使用梭菌路徑產生丙酮 自養性產乙醇梭菌及揚氏梭菌天然地不能產生丙酮，因此將存在於其他梭菌物種中之丙酮生物合成路徑引入兩種生物體中(圖4)。梭菌丙酮生物合成路徑中自乙醯基-CoA至乙醯乙醯基-CoA之第一步驟係由乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶或硫解酶催化。接著由可見於少數生物體(如丙酮丁醇梭菌及拜氏梭菌)中之一組特殊化酶乙酸/丁酸-乙醯乙酸CoA轉移酶複合物及乙醯乙酸去羧酶(表6)催化乙醯乙醯基-CoA轉化成丙酮。 儘管編碼各別酶之丙酮丁醇梭菌基因分成2個操縱子，但拜氏梭菌之基因形成共有操縱子，發明者咸信此會提供優勢。編碼來自丙酮丁醇梭菌之硫解酶之基因及編碼酶乙酸/丁酸-乙醯乙酸CoA轉移酶次單元A、乙酸/丁酸-乙醯乙酸CoA轉移酶次單元B及乙醯乙酸去羧酶之操縱子裝配成在強力天然自養性產乙醇梭菌啟動子控制下之合成操縱子(圖3)。此構築體用於遺傳工程改造兩種生物體以產生丙酮。為產生重組菌株，一種新穎甲基轉移酶用於使該構築體甲基化，該構築體接著經轉型且在自養性產乙醇梭菌DSM23693及揚氏梭菌DSM13528中表現(下文描述)。顯示利用不同工業氣流(軋鋼廠廢氣、合成氣)之丙酮產生。 構築具有梭菌丙酮路徑基因之表現質體： 標準重組DNA及分子選殖技術用於本發明中[Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T：Molecular Cloning：A laboratory Manual,Cold Spring Harbour Labrotary Press,Cold Spring Harbour,1989；Ausubel FM,Brent R,Kingston RE,Moore DD,Seidman JG,Smith JA,Struhl K：Current protocols in molecular biology.John Wiley & Sons,Ltd.,Hoboken,1987]。丙酮生物合成基因之DNA序列展示於表7中。自養性產乙醇梭菌之伍德-永達爾叢集啟動子(在CO去氫酶基因acsA上游)用於表現目標基因(表7)。 使用改進的Bertram及Dürre方法(Conjugal transfer and expression of streptococcal transposons in Clostridium acetobutylicum.Arch Microbiol 1989,151：551-557)使基因組DNA與丙酮丁醇梭菌ATCC824、拜氏梭菌NCIMB8052及自養性產乙醇梭菌DSM10061分離。收集(6,000×g，15分鐘，4℃)100 ml隔夜培養物，用磷酸鉀緩衝液(10 mM，pH 7.5)洗滌且懸浮於1.9 ml STE緩衝液(50 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、200 mM蔗糖；pH 8.0)中。添加300 μl溶菌酶(lysozyme)(約100,000 U)且混合物在37℃下培育30分鐘，隨後添加280 μl 10%(w/v)SDS溶液並再培育10分鐘。藉由添加240 μl EDTA溶液(0.5 M，pH 8)、20 μl Tris-HCl(1 M，pH 7.5)及10 μl RNase A在室溫下消化RNA。接著，添加100 μl蛋白酶K(0.5 U)且在37℃下進行蛋白水解1-3小時。最後，添加600 μl過氯酸鈉(5 M)，隨後進行苯酚-氯仿萃取及異丙醇沈澱。以分光光度法檢查DNA量及品質。 藉由利用表8中之寡核苷酸，使用iProof高保真度DNA聚合酶(Bio-Rad Labratories,Hercules,CA 94547,USA)及下列程式進行PCR來擴增丙酮生物合成基因及伍德-永達爾叢集啟動子：初始在98℃下變性30秒，隨後進行32個變性(98℃ 10秒)、黏接(50-62℃ 30-120秒)及伸長(72℃ 45秒)循環，隨後為最終延伸步驟(72℃ 10分鐘)。 使用NotI及NdeI限制性位點及菌株DH5α-T1R將擴增之伍德-永達爾叢集之573 bp啟動子區(P WL )選殖入大腸桿菌-梭菌穿梭載體pMTL 85141(FJ797651.1；Nigel Minton,University of Nottingham,UK)[Heap JT,Pennington OJ,Cartman ST,Minton NP.A modular system for Clostridium shuttle plasmids.J Microbiol Methods.2009,78：79-85]中。產生之質體pMTL85147及硫解酶基因之1,194 bp PCR產物均用NdeI及EcoRI切割。連接經轉型入大腸桿菌XL1-Blue MRF' Kan中，從而產生質體pMTL85147-thlA。隨後，使用KpnI及BamHI及大腸桿菌ABLE K將擴增之來自拜氏梭菌NCIMB 8052之ctfA-ctfB-adc操縱子的2,177 bp PCR片段選殖入此載體中，從而產生質體pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc。使用表9中提供之寡核苷酸對所得質體pMTL85147-thlA-ctfAB-adc之插入物進行完全定序且結果確認丙酮生物合成基因及啟動子區不含突變(圖5)。 在具有梭菌丙酮路徑基因之大腸桿菌中產生丙酮： 為確認所構築質體之功能性，使用GC及HPLC獲得具有質體pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc之大腸桿菌ABLE K之5 ml隔夜培養物的代謝概況，從而確認丙酮產生。 為進一步對此進行研究，用含有25 μg/ml氯黴素(chloramphenicol)之SD-8基本培養基及攜帶質體pMTL 85147(陰性對照)或表現質體pMTL 85147-thlA-ctfA-ctfB-adc之大腸桿菌XL-1Blue MRF' Kan一式三份進行詳細生長實驗(圖42)。儘管未在陰性對照中觀測到產生丙酮，但量測到攜帶丙酮質體之菌株的平均最高丙酮產量為75.05 mg/L且平均乾生物質量為1.44 g/L。 具有梭菌丙酮路徑基因之表現質體之甲基化： 使用自自養性產乙醇梭菌、羅氏梭菌及揚氏梭菌之甲基轉移酶基因設計之合成雜交第II型甲基轉移酶基因(SEQ_ID NO 35)於大腸桿菌中活體內甲基化丙酮表現質體pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc。甲基轉移酶(SEQ_ID NO 34)經合成且與載體pGS20(ATG：biosynthetics GmbH,Merzhausen,Germany)中之誘導性lac啟動子融合(圖6；SEQ_ID NO 49)。 表現質體與甲基化質體兩者均轉型入相同限制性陰性大腸桿菌XL1-Blue MRF' Kan細胞中，此舉由於兩種質體之革蘭氏(Gram)-(-)複製起點(表現質體中之高複本ColE1及甲基化質體中之低複本p15A)相容而有可能。藉由添加1 mM IPTG誘導活體內甲基化，且使用QIAGEN質體中型套組(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)分離甲基化質體。所得混合物用於用自養性產乙醇梭菌DSM23693及揚氏梭菌DSM 13528進行之轉型實驗，但僅大量(高複本)表現質體具有允許在梭菌中複製之革蘭氏-(+)複製起點(repL)。 於自養性產乙醇梭菌及揚氏梭菌中轉型甲基化丙酮表現質體： 為製備自養性產乙醇梭菌DSM23693及揚氏梭菌DSM13528之勝任細胞，連續3天將50 ml培養物(PETC培養基(表2)，以軋鋼廠氣體及果糖作為碳源；37℃)繼代培養於新鮮培養基。此等細胞用於在OD600nm 0.05下接種50 ml含有40 mM DL-蘇胺酸之PETC培養基。當培養物達到OD600nm 0.4時，細胞轉移入厭氧腔室中且在4,700×g及4℃下加以收集。培養物用冰冷電穿孔緩衝液(270 mM蔗糖、1 mM MgCl2、7 mM磷酸鈉，pH 7.4)洗滌兩次且最終懸浮於500 μl體積之新鮮電穿孔緩衝液中。此混合物轉移入電極間隙為0.4 cm之含有約1 μg甲基化質體混合物之預冷卻電穿孔比色管中。因為相較於自養性產乙醇梭菌，在揚氏梭菌之基因組中鑑別出另一第I型限制性系統，所以添加5 μl第I型限制性抑制劑(EPICENTRE Biotechnologies,Madison,WI 53713,USA)至質體混合物中，此舉使揚氏梭菌之轉型效率增加2-10倍。細胞與質體及限制性抑制劑混合且即刻使用基因脈衝產生器Xcell電穿孔系統(Bio-Rad Labratories,Hercules,CA 94547,USA)以下列設置：2.5 kV、600Ω及25 μF產生脈衝。時間常數介於3.7-5.1 ms之間。對於再生，培養物轉移於增加細胞回收之5 ml特殊再生培養基(表10)中，使用配備有管固持器之Spectronic Helios Epsilon分光光度計(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham MA 02454,USA)在600 nm波長下對細胞回收進行監測。一旦觀測到生長(增加一倍)，即收集細胞，懸浮於200 μl新鮮培養基中且塗鋪於具有15 μg/ml甲碸黴素(thiamphenicol)(溶解於100%(v/v)二甲基呋喃(DMF)中)且頂空中具有30 psi軋鋼廠氣體之選擇性PETC盤上。在4-6天之後可見50-200個群落，其用於接種2 ml含有15 μg/ml甲碸黴素(於DMF中)以及果糖及30 psi軋鋼廠氣體作為碳源之PETC培養基。當出現生長時，將培養物按比例擴大加入5 ml及隨後50 ml各自含有15 μg/ml甲碸黴素(於DMF中)且頂空中含有30 psi軋鋼廠氣體作為唯一碳源之PETC培養基中。 確認用具有梭菌丙酮路徑基因之丙酮質體成功轉型自養性產乙醇梭菌及揚氏梭菌： 為驗證DNA轉移，使用Zyppy質體小型製備套組(Zymo Research,Irvine,CA 92614,USA)自10 ml培養物體積進行質體小型製備。因為由於梭菌外切核酸酶活性[Burchhardt G及Dürre P,Isolation and characterization of DNase-deficient mutants of Clostridium acetobutylicum.Curr Microbiol 1990,21：307-311]而使所分離質體之品質不足以用於限制性消化，所以使用引子ctf-adc-cbei-KpnI-F(Seq_ID no 25)及ctf-adc-cbei-BamH1-R(SEQ_ID NO 26)以所分離質體作為模板來確認質體之存在(圖7)。使用iNtRON極大預混合PCR套組(Intron Bio Technologies)以下列條件進行PCR：初始在94℃下變性2分鐘，隨後進行35個變性(94℃ 20秒)、黏接(55℃ 20秒)及伸長(72℃ 135秒)循環，隨後為最終延伸步驟(72℃ 5分鐘)。 為確認純系之身分，使用以上提供之方案自自養性產乙醇梭菌DSM23693及揚氏梭菌DSM13528各自50 ml培養物分離基因組DNA。使用寡核苷酸fD1(SEQ_ID NO 36：CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG)及rP2(SEQ_ID NO 37：CCCGGGATCCAAGCTTACGGCTACCTTGTTACGACTT)[Weisberg WG,Barns SM,Pelletier BA及Lane DJ,16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.J Bacteriol 1990,173：697-703]及iNtRON極大預混合PCR套組(Intron Bio Technologies,Sangdaewon Joongwon Seognam Kyunggi,Korea)以下列條件針對16s rRNA基因進行PCR：初始在94℃下變性2分鐘，隨後進行35個變性(94℃ 20秒)、黏接(55℃ 20秒)及伸長(72℃ 60秒)循環，隨後為最終延伸步驟(72℃ 5分鐘)。獲得之所有序列相對於自養性產乙醇梭菌(Y18178，GI：7271109)及相應地揚氏梭菌(CP001666.1；GI：300433347)之16s rRNA基因(rrsA)具有>99.9%一致性。 於自養性產乙醇梭菌及揚氏梭菌中用梭菌丙酮路徑基因自CO及CO 2 /H 2 產生丙酮： 用攜帶質體pMTL85147-thlA-ctfAB-adc之經轉型自養性產乙醇梭菌DSM23693及揚氏梭菌DSM 13528在具有橡膠塞且頂空中具有30 psi軋鋼廠氣體(自Glenbrook,NZ之New Zealand Steel地點收集；組成：44% CO、32% N2、22% CO2、2% H2)作為唯一能源及碳源之1 l Schott瓶中於250 ml PETC培養基(表2；無果糖及酵母提取物)中進行生長實驗。使用HPLC及GC分析，用兩種菌株確認丙酮產生。在Schott瓶中，用自養性產乙醇梭菌DSM23693(圖8及10)與揚氏梭菌DSM 13528(圖9及10)兩者在48小時之後均達成約0.3 g/l(6.5 mM)之丙酮濃度。使用適當條件，產生之丙酮可接著進一步轉化成異丙醇。亦證明在血清瓶中自養性產乙醇梭菌DSM23693利用30 psi生物質量合成氣(Range Fuels Inc.,Broomfield,CO；組成：29% CO、45% H2、13% CH4、12% CO2、1% N2)作為唯一能源及碳源產生153 mg/ml丙酮(圖11)。 於自養性產乙醇梭菌中表現異源梭菌丙酮路徑基因： 進行qRT-PCR實驗以確認導致在自養性產乙醇梭菌及揚氏梭菌中產生丙酮之引入基因thlA、ctfA、ctfB及adc的成功表現。可成功偵測所有基因之信號(圖52及53)。 具有質體pMTL85147之自養性產乙醇梭菌及揚氏梭菌之各自50 ml培養物藉由離心(6,000×g，5分鐘，4℃)加以收集，瞬間冷凍於液氮中且儲存在-80℃下直至RNA提取。使用PureLinkTM RNA小型套組(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分離總RNA且溶離於100 μL不含RNase之水中。在DNase I處理(Roche Applied Science,Indianapolis,IN,USA)之後，接著使用SuperScript III逆轉錄酶套組(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)進行逆轉錄步驟。使用Agilent生物分析儀2100(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)、Qubit螢光計(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)且藉由凝膠電泳檢查RNA。對於每一引子對，進行非逆轉錄(RT)對照(non-RT control)。所有qRT-PCR反應皆使用MyiQ單色偵測系統(Bio-Rad Labratories,Carlsbad,CA,USA)，用25 ng cDNA模板、67 nM各引子(表17)及1×iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad Labratories,Carlsbad,CA,USA)以總反應體積15 μL一式兩份進行。反應條件為95℃ 3分鐘，隨後進行40個95℃ 15 s、55℃ 15 s及72℃ 30 s循環。對於偵測引子二聚化或其他擴增人工產物，在完成qPCR(38個在1℃/s下之58℃至95℃循環)之後即刻進行熔融曲線分析。各cDNA樣品包括兩個管家基因(鳥苷酸激酶及甲酸四氫葉酸連接酶)以達成正規化。使用相對表現軟體工具(REST©)2008 V2.0.7(38)推導出相對基因表現。跨越4個對數單位之cDNA稀釋系列用於產生標準曲線且所得擴增效率用於計算mRNA濃度。 由自養性產乙醇梭菌、揚氏梭菌及羅氏梭菌將丙酮轉化成異丙醇： 丙酮可由醇去氫酶作用進一步轉化成異丙醇。然而，描述僅少數微生物(諸如拜氏梭菌NRRL-B593)會產生異丙醇，且丙酮至異丙醇轉化酶在自然界中極稀少。迄今為止僅已鑑別並描述來自拜氏梭菌NRRL-B593[Ismaiel AA,Zhu CX,Colby GD,Chen JS：Purification and characterization of a primary-secondary alcohol dehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii.J Bacteriol 1993,175：5097-5105](SEQ_ID NO 38-39)及布氏嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter brockii)[Peretz M及Burstein Y：Amino acid sequence of alcohol dehydrogenase from the thermophilic bacterium Thermoanaerobium brockii.Biochemistry.1989,28：6549-6555](SEQ_ID NO 40-41)之兩種二級醇去氫酶。 因此，測試微生物集合-產乙酸細菌、丙酮及異丙醇產生性梭菌及大腸桿菌之將丙酮轉化成異丙醇之能力(表11)。 所有培養物皆於50 ml含有異養碳源及30 psi軋鋼廠氣體之適當培養基中接種直至OD600nm 0.1。在添加丙酮之前使培養物加倍(OD600nm=0.2)。在丙酮添加之後即刻及亦在生長結束時獲取樣品並藉由HPLC及GC加以分析(隨後量測光學密度)。結果概述於表11中。空白培養基用作陰性對照。 如所預期，異丙醇產生性菌株拜氏梭菌NRRL-B593[George HA,Johnson JL,Moore WEC,Holdeman LV,Chen JS：Acetone,isopropanol,and butanol production by Clostridium beijerinckii(syn.Clostridium butylicum)and Clostridium aurantibutyricum.Appl Environ Microbiol 45：1160-1163]能夠由其醇去氫酶的作用在外部將添加之丙酮還原成異丙醇。與丙酮產生性丙酮丁醇梭菌ATCC-824一樣，缺乏此酶之不同拜氏梭菌菌株NRCIMB8052不能將丙酮轉化成異丙醇。相同結果亦對大腸桿菌成立。 驚人地，發現形成梭菌rRNA同源組I內之子叢集之三種一氧化碳營養性產乙酸細菌自養性產乙醇梭菌、揚氏梭菌及羅氏梭菌亦能夠將丙酮轉化成異丙醇，而測試之所有其他產乙酸細菌皆不可利用丙酮(表11)。接著使用不同濃度測試不同量之丙酮由自養性產乙醇梭菌轉化成異丙醇(表12)。 用自養性產乙醇梭菌DSM23693進行反應器研究以證明丙酮以高速率有效轉化成異丙醇。如上所述設置反應器。一旦處於伴有穩定生物質量及代謝物產生之連續模式，即添加丙酮至生物反應器與饋料培養基兩者中。丙酮外加入反應器中直至某一含量，該含量接著藉由連續饋料獲得。最初，添加1 g/L丙酮，一旦代謝物濃度已穩定，即增加濃度至5 g/L、15 g/l，且在第二實驗中增加至20 g/L。即使在20 g/L之高濃度下，培養物亦以高速率將所有丙酮轉化成異丙醇，證明鑑別出之一級：二級醇去氫酶高度有效(圖74)。 鑑別自養性產乙醇梭菌、揚氏梭菌及羅氏梭菌中之一種新穎醇去氫酶： 為確認丙酮由自養性產乙醇梭菌轉化成異丙醇係酶促驅動，根據Ismaiel等人[Ismaiel AA,Zhu CX,Colby GD,Chen JS：Purification and characterization of a primary-secondary alcohol dehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii.J Bacteriol 1993,175：5097-5105]用自養性產乙醇梭菌23693、拜氏梭菌NRRL-B593及梭菌(C.carboxidivorans)DSM15243之粗提取物進行酶分析。藉由對指數生長末期培養物進行音波處理及溶菌酶處理(100,000 U/ml)來獲得粗提取物。藉由離心移除細胞碎片且使用Pierce還原劑相容性BCA蛋白質分析(the Pierce BCA protein assay-reducing agent compatible)(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham MA 02454,USA)測定蛋白質濃度。分析混合物(1 ml)含有50 mM Tris緩衝劑(pH 7.5)、1 mM二硫蘇糖醇(DTT)及0.2 mM NAD(P)H。藉由添加10 mM基質丙酮(來自於水中之10倍稀釋液)起始反應且隨後用Spectramax M2(Molecular Devices,Inc.,Sunnyvale,CA 94089-1136,USA)在365 nm波長下進行分光光度量測。H2O用作陰性對照替代粗提取物以及相應地丙酮。用拜氏梭菌與自養性產乙醇梭菌兩者之粗提取物及NADPH(不含有NADH)可偵測到酶活性，但用梭菌(C.carboxidivorans)DSM15243之粗提取物或H2O(含有NADPH與NADH兩者)不可偵測到酶活性。此證明丙酮由自養性產乙醇梭菌轉化成異丙醇係酶促驅動，且因為用NADH未偵測到活性，所以酶似乎為NADPH依賴性酶。 藉由定序及仔細分析，鑑別出所有三種菌株自養性產乙醇梭菌、揚氏梭菌及羅氏梭菌中之一種新穎醇去氫酶基因/酶(圖1；SEQ_ID NO.1-4)。發現所有三個物種中之胺基酸序列相同且與拜氏梭菌NRRL-B593(87%)及布氏嗜熱厭氧桿菌ATCC 53556(76%)之一級-二級醇去氫酶共有一定同源性(表13)。相較於拜氏梭菌NRRL-B593之經充分描述之二級醇去氫酶[Ismaiel AA,Zhu CX,Colby GD,Chen JS：Purification and characterization of a primary-secondary alcohol dehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii.J Bacteriol 1993,175：5097-5105]，發現總計49個胺基酸交換。蛋白質之催化中心中之4個胺基酸保守，然而，催化域中之其他胺基酸並非如此(圖1)。基元搜尋預測該新穎醇去氫酶基因/酶具有鋅及NAD(P)H依賴性。發現編碼該新穎醇去氫酶之各別基因在3個物種自養性產乙醇梭菌、揚氏梭菌及羅氏梭菌內具有98%一致性，但僅82%一致於拜氏梭菌之醇去氫酶及72%一致於布氏嗜熱厭氧桿菌之醇去氫酶(表14)。 來自自養性產乙醇梭菌之新穎醇去氫酶之表現研究 為鑑別編碼新穎醇去氫酶之基因在用自養性產乙醇梭菌進行之正常醱酵期間是否具有活性並鑑別基因過度表現之潛在啟動子區，用超過250種基因進行qRT-PCR研究。 歷經整個生長時期(4天)自如上所述操作之典型1.5 l饋料批式醱酵獲取樣品。藉由離心(6,000×g，5分鐘，4℃)收集樣品且細胞小球瞬間冷凍於液氮中並儲存在-80℃下直至使用。藉由在冰上解凍細胞小球分離RNA且將其懸浮於100 μL溶菌酶溶液(50,000 U溶菌酶、0.5 μL 10% SDS、10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA；pH 8)中。5分鐘之後，添加350 μL溶解緩衝液(含有10 μL 2-巰基乙醇)。細胞懸浮液藉由穿過第18-21號針五次而機械破壞。接著使用PureLinkTM RNA小型套組(Invitrogen,Carlsbad,CA 92008,USA)分離RNA且溶離於100 μL不含RNase之水中。RNA經由PCR及凝膠電泳檢查並以分光光度法定量，且必要時用DNase I(Roche)處理。使用SuperScript III逆轉錄酶套組(Invitrogen,Carlsbad,CA 92008,USA)執行逆轉錄步驟。RT-PCR反應係於MyiQ單色即時PCR偵測系統(Bio-Rad Labratories,Hercules,CA 94547,USA)中，用25 ng cDNA模板、67 nM各引子(表15)及1×iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad Labratories,Hercules,CA 94547,USA)以反應體積15 μL進行。鳥苷酸激酶(GnK)及甲酸四氫葉酸連接酶(FoT4L)用作管家基因且包括非模板對照。反應條件為95℃ 3分鐘，隨後進行40個95℃ 15 s、55℃ 15 s及72℃ 30 s循環。在完成qRT PCR(38個以1℃/s自58℃至95℃之循環)之後即刻進行熔融曲線分析以偵測引子二聚化或其他擴增人工產物。以如藉由Biorad iQ5 2.0軟體計算得到之基於減掉PCR基線之曲線擬合法的臨限循環(Ct)值形式計算關於表現量之資料。使用相對表現軟體工具(REST©)2008 V2.0.7進一步分析原始Ct值。 qRT-PCR研究之結果顯示新穎醇去氫酶之基因歷經整個生長時期在相對恆定量下表現且僅在生長結束時停止(圖2)。相較於選自代謝之每一部分之超過200種基因，醇去氫酶基因屬於排名前50之表現基因。所分析之所有基因之最高基因表現顯示伍德-永達爾操縱子之基因之mRNA含量比醇去氫酶基因高10倍以上(圖2)。因此，理想的是各別啟動子(SEQ_ID NO 22)區過度表現基因，諸如丙酮生物合成酶之基因及醇去氫酶基因，但在微生物天然醇去氫酶基因過度表現之情況下，可能需要額外基因改造以確保足夠輔因子可用性。此可包括例如(過度)表現其他基因以增加NADPH池(諸如轉氫酶)、消除競爭性NADPH消耗反應或蛋白質工程改造以改變NADH所需之輔因子。鑑別之適用於基因過度表現之其他啟動子區包括F1FO-ATPase操縱子之啟動子區(SEQ_ID NO 51)、Rnf複合操縱子之啟動子區(SEQ_ID NO 52)及丙酮酸：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶之啟動子區(SEQ_ID NO 53)。 由具有含梭菌丙酮基因之表現質體的自養性產乙醇梭菌及揚氏梭菌自CO及C0 2 /H 2 產生異丙醇 顯示攜帶丙酮表現質體pMTL85147-thlA-ctfAB-adc之重組自養性產乙醇梭菌DSM23693及揚氏梭菌DSM 13528菌株之250 ml Schott瓶培養物會產生丙酮，但未偵測到異丙醇(圖8+9)。此可能歸因於在生長結束時由於Schott瓶中之頂空CO耗盡且未如在饋料批式或連續醱酵過程中一般進行恆定饋料的既定靜態條件而缺乏還原力。諸如NAD(P)H或鐵氧化還原蛋白之還原等效物自CO產生，但亦經消耗以用於乙醇產生，此已在指數生長及早期穩定生長期間發生。此時，作為產生異丙醇之前驅體而被需要產生之丙酮的濃度仍然相對較低。 因此，兩種培養物在生長48小時之後均用30 psi新鮮軋鋼廠氣體再充氣且亦再接種。儘管生物質量並未進一步增加許多，但一些產生之丙酮在24小時內轉化成異丙醇(表16)。 在恆定供應CO之醱酵系統中，存在足夠還原力以自CO或CO/H2連續產生異丙醇且丙酮與異丙醇兩者均在用攜帶丙酮表現質體pMTL85147-thlA-ctfAB-adc之自養性產乙醇梭菌DSM23693操作之各別醱酵中產生。 選殖新穎醇去氫酶 新穎醇去氫酶選殖入丙酮表現質體中且置於伍德-永達爾啟動子控制之下以達成在大腸桿菌中之基因過度表現及功能性測試。 使用寡核苷酸SecAdh-SalI-F(SEQ_ID NO 54：TATTTGTCGACTTAGGAGGTTCTATTATGAAAGG)及SecAdh-XhoI-R(SEQ_ID NO 55：AAAACTCGAGACATTTTTTTAATGCGACAG)自經分離自養性產乙醇梭菌DSM10061染色體DNA擴增醇去氫酶。使用SalI及XhoI及大腸桿菌XL-1 Blue MRF' Kan將1129 bp PCR片段選殖入質體pMTL85147-thlA-ctfAB-adc中。使用表9中提供之寡核苷酸對所得質體pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc-adh(SEQ_ID NO 48；圖43)進行完全定序且結果確認異丙醇生物合成基因及啟動子區不含突變(圖41)。 於大腸桿菌中用來自自養性產乙醇梭菌之新穎醇去氫酶產生異丙醇 為進一步測試來自自養性產乙醇梭菌之新穎醇去氫酶之功能性，使用僅表現丙酮生物合成基因(攜帶質體pMTL 85147-thlA-ctfA-ctfB-adc)以及表現丙酮生物合成基因加新穎醇去氫酶(攜帶質體pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc-adh)之大腸桿菌XL-1 Blue MRF' Kan於100 ml含有氯黴素之SD-8基本培養基中進行生長實驗(圖42)。 儘管在攜帶丙酮質體之菌株之情況下不可偵測到異丙醇，但在另外表現來自自養性產乙醇梭菌之新穎醇去氫酶之菌株的情況下量測到平均最大值為32.7 mg/L之異丙醇。 自雷特氏乳球菌及釀酒酵母鑑別在自養性產乙醇梭菌中對丙酮或異丙醇賦予新穎活性之基因 除梭菌丙酮及異丙醇路徑之外，亦鑑別出在自養性產乙醇梭菌中對丙酮及異丙醇產生賦予活性之兩種酶，即來自雷特氏乳球菌之α-酮基異戊酸去羧酶(KivD)及來自釀酒酵母之醇去氫酶(Adh2)(表18)。彼兩種酶尚未報導與丙酮或異丙醇產生有關或對梭菌丙酮及異丙醇路徑中之任何前驅體具有催化功能。此等蛋白質於大腸桿菌(Atsumi等人，2008.Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.Nature,451：86-90)或其他生物體，如穀胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)(Blombach等人，2011.Corynebacterium glutamicum tailored for efficient Isobutanol production.Appl.Environ.Microbiol.77：3300-10)或解纖維梭菌(Clostridium cellulolyticum)(Higashide W.，等人2011.Metabolic Engineering of Clostridium cellulolyticum for Production of Isobutanol from Cellulose.Appl.Environ.Microbiol.77：2727-33)中之異源表現導致自胺基酸前驅體產生分支鏈高級醇，如異丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇及2-苯乙醇，但未報導會產生丙酮或異丁醇。然而，來自雷特氏乳球菌之密碼子優化α-酮基異戊酸去羧酶(KivD)單獨或來自雷特氏乳球菌之密碼子優化α-酮基異戊酸去羧酶(KivD)與來自釀酒酵母之醇去氫酶(Adh2)之組合於自養性產乙醇梭菌中的表現驚人地導致產生丙酮及異丙醇。 構築具有來自雷特氏乳球菌之α-酮基異戊酸去羧酶(KivD)及來自釀酒酵母之醇去氫酶(Adh2)的表現質體 來自雷特氏乳球菌之α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)及來自釀酒酵母之醇去氫酶(Adh2)(表18)由ATG：Biosynthetics GmbH(Merzhausen,Germany)密碼子優化且側接NdeI及KpnI限制性位點以用於進一步次選殖。自養性產乙醇梭菌之磷酸轉乙醯酶/乙酸激酶操縱子啟動子用於表現目標基因。所用所有DNA序列皆提供於表19中。 使用引子Ppta-ack-NotI-F(Seq.ID.No.80：GAGCGGCCGCAATATGATATTTATGTCC)及Ppta-ack-NdeI-R(Seq.ID.No.81：TTCCATATGTTTCATGTTCATTTCCTCC)擴增磷酸轉乙醯酶-乙酸激酶操縱子之啟動子區(P pta-ack )且使用NotI及NdeI限制性位點及菌株XL1-Blue MRF' Kan選殖入大腸桿菌-梭菌穿梭載體pMTL 85141(FJ797651.1；Nigel Minton,University of Nottingham,UK)[Heap JT,Pennington OJ,Cartman ST,Minton NP.A modular system for Clostridium shuttle plasmids.J Microbiol Methods.2009,78：79-85]中。 隨後使用FseI及PmeI限制性位點及菌株XL1-Blue MRF' Kan用來自pMTL 82254(FJ797646.1；Nigel Minton,University of Nottingham,UK)[Heap JT,Pennington OJ,Cartman ST,Minton NP.A modular system for Clostridium shuttle plasmids.J Microbiol Methods.2009,78：79-85]之紅黴素(erythromycin)抗性基因替換所產生之質體pMTL85145中之抗生素抗性基因。 產生之質體pMTL85245(Seq.ID.No.80)及去羧酶及醇去氫酶(Adh2)基因叢之2746 bp密碼子優化產物均用NdeI及KpnI切割。連接經轉型入大腸桿菌XL1-Blue MRF' Kan中，從而產生質體pMTL85245-kivd-adh2(Seq.ID.No.83；圖63)。使用表20中提供之寡核苷酸對所得質體pMTL85245-kivd-adh之插入物進行完全定序且結果確認基因及啟動子區不含突變。 使用引子對M13反向(Seq.ID.57：CAGGAAACAGCTATGAC)及Adh_seqR1(Seq.ID.85；表16)擴增單獨kivD基因。使用NdeI及EcoRI限制性位點及菌株大腸桿菌XL1-Blue MRF' Kan將KivD之2635 bp PCR片段選殖入大腸桿菌-梭菌穿梭載體pMTL 85245中，從而產生質體pMTL85245-kivd(Seq.ID No.84；圖64)。使用表20中提供之寡核苷酸對所得質體pMTL85245-kivd之插入物進行完全定序且結果確認丙酮生物合成基因不含突變。 於自養性產乙醇梭菌中表現來自雷特氏乳球菌之α-酮基異戊酸去羧酶(KivD)及來自釀酒酵母之醇去氫酶(Adh2)之密碼子優化基因以產生丙酮及異丙醇 構築之表現質體pMTL85245-kivd-adh2及pMTL85245-kivd轉型入大腸桿菌菌株JW3350-2中且加以製備以用於如上所述進行的於自養性產乙醇梭菌DSM23693中之轉型。儘管在具有兩種質體之大腸桿菌中，丙酮與異丙醇兩者均不可偵測(但如文獻中所述，可偵測到諸如異丁醇之分支鏈高級醇)，但在自養性產乙醇梭菌中，丙酮與異丙醇兩者均可偵測。在血清瓶實驗中，對於兩種表現質體，自含有CO之軋鋼廠氣體獲得之最高異丙醇濃度為0.050-0.064 g/L(圖65及66)。 用梭菌路徑基因與來自雷特氏乳球菌之α-酮基異戊酸去羧酶(KivD)及來自釀酒酵母之醇去氫酶(Adh2)的組合產生丙酮及異丙醇 在不意欲受任何特定理論束縛之情況下，發明者咸信與梭菌乙醯乙酸去羧酶一樣，來自雷特氏乳球菌之密碼子優化α-酮酸去羧酶Kivd具有將乙醯乙酸轉化成丙酮之活性，而與鑑別之新穎一級：二級醇去氫酶或來自拜氏梭菌之一級：二級醇去氫酶一樣，來自釀酒酵母之密碼子優化醇去氫酶Adh2具有將丙酮轉化成異丙醇之活性。為檢驗此假設，梭菌丙酮/異丙醇路徑基因與來自雷特氏乳球菌之α-酮酸去羧酶Kivd及來自釀酒酵母之醇去氫酶Adh2的若干組合已經產生且在大腸桿菌及自養性產乙醇梭菌內加以測試，顯示會產生丙酮及異丙醇。 構築具有不同基因組合之表現質體 基於構築之表現質體pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc、pMTL85245-kivd-adh2及pMTL85245-kivd，構築新組合。 使用寡核苷酸P-thl-ctfAB_F2(Seq.ID.No.93：ATCTTCTGCAGGGCCGCAGATAGTCATAATAGTTCCAG)及P-thl-ctfAB_R2(Seq.ID.No.94：AGGGTGCGGCCGCGATTCATATATCCATAATCTTTAAGTTATC)自質體pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc擴增3122 bp PWL-thlA-ctfAB片段。使用PstI及NotI限制性位點及菌株大腸桿菌XL1-Blue MRF' Kan將擴增之片段選殖入質體pMTL 85245-kivd中，從而產生質體pMTL85245-PWL-thlA-ctfAB-kivd(Seq.ID.No.95；圖67)。使用表9及20中提供之寡核苷酸對所得質體pMTL85245-PWL-thlA-ctfAB-kivd之插入物進行完全定序且確認質體不含突變。 使用引子對adh_F(Seq.ID.No.96：ACGTTGGATCCAGGAGGAACAAAGATGAGTATACC)及P-kivd-adh_R(Seq.ID.No.97：AGCGTCCATGGCCTTATTTACTTGTATCTACAACATATC)自質體pMTL85245-kivd-adh2擴增Adh2基因。使用BamHI及NcoI限制性位點及菌株大腸桿菌XL1-Blue MRF' Kan將1084 bp PCR片段選殖入質體pMTL85147-thlA-ctfAB-adc中，從而產生質體pMTL85147-thlA-ctfAB-adc-adh2(Seq.ID.No.98；圖68)。產生之質體pMTL85147-thlA-ctfAB-adc-adh2及來自pMTL83151(FJ797647.1；Nigel Minton,University of Nottingham,UK)[Heap JT,Pennington OJ,Cartman ST,Minton NP.A modular system for Clostridium shuttle plasmids.J Microbiol Methods.2009,78：79-85]之repL基因之1625 bp片段均用FseI及AscI切割。進行連接，從而產生質體pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-adh2。使用表9及20中提供之寡核苷酸對所得質體pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-adh2之插入物進行完全定序且結果確認片段不含突變。 寡核苷酸P-kivd-adh_F(Seq.ID.No.99：ATATTGGATCCACAGCTATGACCGCGGCCGCAATATG)及P-kivd-adh_R(Seq.ID.No.100：AGCGTCCATGGCCTTATTTACTTGTATCTACAACATATC)用於自質體pMTL85245-kivd-adh2擴增Ppta-ack-kivd-adh2之3266 bp PCR片段，其接著使用BamHI及NcoI限制性位點及菌株大腸桿菌XL1-Blue MRF' Kan選殖入質體pMTL85147-thlA-ctfAB-adc中，從而產生質體pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-Ppta-ack-kivd-adh2(Seq.ID.101；圖69)。產生之質體pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-Ppta-ack-kivd-adh2及來自pMTL83151(FJ797647.1；Nigel Minton,University of Nottingham,UK)[Heap JT,Pennington OJ,Cartman ST,Minton NP.A modular system for Clostridium shuttle plasmids.J Microbiol Methods.2009,78：79-85]之repL基因之1625 bp片段均用FseI及AscI切割。進行連接，從而產生質體pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-Ppta-ack-kivd-adh2。使用表9中提供之寡核苷酸對所得質體pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-Ppta-ack-kivd-adh2之插入物進行完全定序且結果確認質體不含突變。 使用不同基因組合於自養性產乙醇梭菌中產生丙酮及異丙醇 使用自自養性產乙醇梭菌、羅氏梭菌及揚氏梭菌之甲基轉移酶基因設計之合成雜交第II型甲基轉移酶基因(SEQ_ID NO 35)於大腸桿菌中活體內甲基化新構築之表現質體pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc、pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-adh2及pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-Ppta-ack-kivd-adh2且如上所述轉型入自養性產乙醇梭菌DSM23693中。 所有質體構築體皆使用血清瓶實驗以糖(大腸桿菌)或含有CO之軋鋼廠氣體(自養性產乙醇梭菌)作為唯一基質在大腸桿菌及自養性產乙醇梭菌DSM23693中測試。在測試之所有組合之情況下，當異源表現於自養性產乙醇梭菌中時皆量測到丙酮及異丙醇產生，而在大腸桿菌中，僅少數組合發生丙酮產生且醇去氫酶基因為異丙醇產生所需(表21)。呈現之結果顯示在大腸桿菌以及自養性產乙醇梭菌兩者中，來自雷特氏乳球菌之密碼子優化α-酮酸去羧酶Kivd均能夠替代梭菌乙醯乙酸去羧酶且催化乙醯乙酸轉化成丙酮(圖4)。在自養性產乙醇梭菌中，即使在去羧酶表現為唯一異源基因之情況下亦產生丙酮及異丙醇，從而指示CoA轉移酶活性。圖4說明自CO形成丙酮及異丙醇之提議路徑及表21且圖73提供對梭菌路徑基因與來自雷特氏乳球菌之α-酮酸去羧酶Kivd及來自釀酒酵母之醇去氫酶Adh2之密碼子優化基因的組合於大腸桿菌及自養性產乙醇梭菌中測試之概述。 用自養性產乙醇梭菌DSM23693及質體pMTL85245-PWL-thlA-ctfAB-kivd、pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-adh2及pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-Ppta-ack-kivd-adh2自含有CO之軋鋼廠氣體產生丙酮及異丙醇分別展示於圖70、71及72中。 產乙酸菌中對丙酮及異丙醇之耐受性及乙酸之去毒 已知諸如醇(乙醇及丁醇)或酸(乙酸及丁酸)之若干代謝物在高濃度下對細菌有毒且因此限制其生物技術生產[Alsaker KV,Parades C,Papoutsakis ET：Metabolite stress and tolerance in the production of biofuels and chemicals-systems analysis of butanol,butyrate,and Acetate Stresses in the Anaerobe Clostridium acetobutylicum.Biotechnol Bioeng,2009,105：1131-1147]。為查明丙酮及異丙醇是否對培養物具有毒性作用，添加不同濃度之丙酮(圖12)及異丙醇(圖13)至自養性產乙醇梭菌DSM23693之生長培養物中，在血清瓶中於50 ml PETC培養基(表2)中進行生長實驗。在濃度高達5%之丙酮或異丙醇存在下可見細胞生長(生長速率僅受略微抑制)。 另一方面，已知高濃度之游離或未解離乙酸歸因於對膜梯度之不利影響而對大多數厭氧細菌(包括產乙酸細菌)有害[Warnecke T,Gill RT：Organic acid toxicity,tolerance,and production in Escherichia coli biorefining applications.Microb Cell Fact,2005,4：25；Köpke M,Dürre P：Biochemical production of biobutanol,Luque R,Campelo J,Clark JH(編)：Handbook of biofuel production-Processes and technologies,Woodhead Publishing,Camebridge,2010：221-257]。然而，產乙酸細菌需要產生乙酸以自受質層級磷酸化(substrate level phosphorylation)獲得ATP[Drake HL,Küsel K,Matthies C：Acetogenic Prokaryotes.Dworkin M,Falkow S,Rosenberg E,Schleifer KH,Stackebrandt E(編)：The Prokaryotes，第3版，第2卷，Springer,New York,2006：354-420]且因此所有已知產乙酸物種皆產生乙酸[Drake HL,Küsel K,Matthies C：Acetogenic Prokaryotes.Dworkin M,Falkow S,Rosenberg E,Schleifer KH,Stackebrandt E(編)：The Prokaryotes，第3版，第2卷，Springer,New York,2006：354-420]。因為呈還原鐵氧化還原蛋白或ATP形式需要能量[Wolfe AJ：The acetate switch.Microbiol Mol Biol Rev,2005,69：12-50]，乙酸經由醛鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(AOR)轉化成諸如乙醇之其他產物或經由磷酸轉乙醯酶/乙酸激酶(Pta/Ack)或AMP依賴性乙醯基-CoA合成酶(Acs)轉回乙醯基-CoA為不利的。本發明提供產乙酸細菌中之一種新穎乙酸去毒模式，其無能量要求。乙酸可經由由乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶、乙醯乙醯基-CoA：乙酸/丁酸輔酶A轉移酶A、乙醯乙醯基-CoA：乙酸/丁酸輔酶A轉移酶B組成之乙醯乙醯基-CoA：乙酸/丁酸輔酶A轉移酶系統再循環回乙醯基-CoA。此反應驅動乙醯乙醯基-CoA轉化成乙醯乙酸，其可接著脫去羧基成為丙酮並還原成異丙醇(圖4)。 本發明已在本文中參考某些較佳實施例加以描述以使得讀者能夠在不進行過度實驗之情況下實施本發明。然而，一般技術者將易於認識到許多組分及參數可在不脫離本發明之範疇的情況下在一定程度上變化或修改或替代成已知等效物。應瞭解此等修改及等效物就如同個別地加以闡述一樣併入本文中。提供標題、標頭或其類似物以增強讀者對本文件之理解，且不應視為限制本發明之範疇。 上文及下文引用之所有申請案、專利及公開案之全部揭示內容(若存在)據此以引用的方式併入本文中。然而，本說明書中對任何申請案、專利及公開案之提及並非且不應視為承認或任何形式之暗示其構成有效先前技術或形成世界上任何國家之一般通常知識之一部分。 在整篇本說明書及隨後任何申請專利範圍中，除非上下文另外需要，否則用詞「包含(comprise)」、「包含(comprising)」及其類似用詞應以與排他意義相反之包括意義加以解釋，亦即以「包括(但不限於)」之意義加以解釋。 圖1展示自養性產乙醇梭菌(CAU)、揚氏梭菌(CLJ)及羅氏梭菌(CRA)之新穎醇去氫酶與拜氏梭菌菌株NRRL-B593之二級醇去氫酶的胺基酸比對。 圖2展示在典型醱酵操作期間自養性產乙醇梭菌DSM23693之新穎醇去氫酶基因之表現、以及由伍德-永達爾操縱子啟動子、F1FO ATPase操縱子啟動子、Rnf複合操縱子啟動子及丙酮酸：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶啟動子控制之基因表現。比較超過200種相關基因之mRNA含量。 圖3展示丙酮表現質體pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc。 圖4展示經工程改造之攜帶質體pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc之自養性產乙醇梭菌及揚氏梭菌中的自含有CO或CO/H2之氣體產生丙酮及異丙醇之路徑。 圖5展示丙酮表現質體pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc之定序結果。 圖6說明設計之甲基化質體。 圖7展示對與經轉型自養性產乙醇梭菌DSM23693及揚氏梭菌DSM13528分離之質體之來自PCR的ctfAB-adc(2.2 kb)的偵測。序列梯=1 KB加DNA梯(Invitrogen)；1=非模板對照；2=自自養性產乙醇梭菌分離之質體；3=自揚氏梭菌分離之質體；4=原始pMTL85147-thlA-ctfAB-adc(陽性對照)。 圖8展示自養性產乙醇梭菌DSM23693+pMTL85147-thlA-ctfAB-adc利用軋鋼廠氣體之生長實驗之結果。 圖9展示揚氏梭菌DSM13528+pMTL85147-thlA-ctfAB-adc利用軋鋼廠氣體之生長實驗之結果。 圖10展示確認用自養性產乙醇梭菌DSM13528+pMTL85147-thlA-ctfAB-adc(上圖)及揚氏梭菌DSM13528+pMTL85147-thlA-ctfAB-adc(下圖)自軋鋼廠氣體產生丙酮之GC結果。 圖11展示確認用自養性產乙醇梭菌DSM23693+pMTL85147-thlA-ctfAB-adc自合成氣產生丙酮之GC結果。 圖12展示丙酮對自養性產乙醇梭菌DSM23693之培養物之毒性。 圖13展示異丙醇對自養性產乙醇梭菌DSM23693之培養物之毒性。 圖14展示SEQ_ID NO 1：來自自養性產乙醇梭菌、揚氏梭菌及羅氏梭菌之新穎醇去氫酶之胺基酸序列。 圖15展示SEQ_ID NO 2：來自自養性產乙醇梭菌之新穎醇去氫酶基因之核酸序列。 圖16展示SEQ_ID NO 3：來自揚氏梭菌之新穎醇去氫酶基因之核酸序列。 圖17展示SEQ_ID NO 4：來自羅氏梭菌之新穎醇去氫酶基因之核酸序列。 圖18展示SEQ_ID NO 18：來自丙酮丁醇梭菌ATCC824之硫解酶基因(thlA)之核酸序列。 圖19展示SEQ_ID NO 19：來自拜氏梭菌NCIMB8052之乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(ctfA)基因之核酸序列。 圖20展示SEQ_ID NO 20：來自拜氏梭菌NCIMB8052之乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(ctfB)基因之核酸序列。 圖21展示SEQ_ID NO 21：來自拜氏梭菌NCIMB8052之乙醯乙酸去羧酶(adc)基因之核酸序列。 圖22展示SEQ_ID NO 22：來自自養性產乙醇梭菌之伍德-永達爾叢集啟動子(PWL)之核酸序列。 圖23展示SEQ_ID NO 34：設計之第II型甲基轉移酶基因之胺基酸序列。 圖24展示SEQ_ID NO 35：設計之第II型甲基轉移酶基因之核酸序列。 圖25展示SEQ_ID NO 38：來自拜氏梭菌NRRL B-593之NADP依賴性醇去氫酶之胺基酸序列。 圖26展示SEQ_ID NO 39：來自拜氏梭菌NRRL B-593之NADP依賴性醇去氫酶之核酸序列。 圖27展示SEQ_ID NO 40：來自布氏嗜熱厭氧桿菌ATCC 53556之NADP依賴性醇去氫酶之胺基酸序列。 圖28展示SEQ_ID NO 41：來自布氏嗜熱厭氧桿菌之醇去氫酶之核酸序列。 圖29展示SEQ_ID NO 42：來自丙酮丁醇梭菌ATCC824之硫解酶ThlA之胺基酸序列。 圖30展示SEQ_ID NO 43：來自拜氏梭菌NCIMB8052之乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A CtfA之胺基酸序列。 圖31展示SEQ_ID NO 44：來自拜氏梭菌NCIMB8052之乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A CtfB之胺基酸序列。 圖32展示SEQ_ID NO 45：來自拜氏梭菌NCIMB8052之乙醯乙酸去羧酶Adc之胺基酸序列。 圖33展示SEQ_ID NO 46：含有新穎醇去氫酶之表現質體pMTL85147-thlA-ctfAB-adc之核酸序列。 圖34展示SEQ_ID NO 47：拜氏梭菌之乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(ctfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(ctfB)及乙醯乙酸去羧酶(adc)操縱子之核酸序列。 圖35展示SEQ_ID NO 48：含有新穎醇去氫酶之表現質體pMTL85147-thlA-ctfAB-adc-adh之核酸序列。 圖36展示SEQ_ID NO 49：設計之甲基化質體之核酸序列。 圖37展示SEQ_ID NO 50：lac啟動子之核酸序列。 圖38展示SEQ_ID NO 51：自養性產乙醇梭菌F1FO ATPase操縱子啟動子區之核酸序列。 圖39展示SEQ_ID NO 52：自養性產乙醇梭菌Rnf複合操縱子啟動子區之核酸序列。 圖40展示SEQ_ID NO 53：自養性產乙醇梭菌丙酮酸：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶啟動子區之核酸序列。 圖41展示含有新穎醇去氫酶之表現質體pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc-adh之定序結果。 圖42展示用攜帶對照質體(pMTL85147)、丙酮表現質體(pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc)及包括新穎醇去氫酶之丙酮表現質體(pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc-adh)之大腸桿菌XL-1 Blue MRF' Kan產生丙酮及異丙醇之結果。 圖43展示含有新穎醇去氫酶之表現質體pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc-adh。 圖44展示SEQ_ID NO 56：來自揚氏梭菌之伍德-永達爾叢集啟動子(PWL)之核酸序列。 圖45展示SEQ_ID NO 57：來自羅氏梭菌之伍德-永達爾叢集啟動子(PWL)之核酸序列。 圖46展示SEQ_ID NO 58：揚氏梭菌F1FO ATPase操縱子啟動子區之核酸序列。 圖47展示SEQ_ID NO 59：羅氏梭菌F1FO ATPase操縱子啟動子區之核酸序列。 圖48展示SEQ_ID NO 60：揚氏梭菌Rnf複合操縱子啟動子區之核酸序列。 圖49展示SEQ_ID NO 61：羅氏梭菌Rnf複合操縱子啟動子區之核酸序列。 圖50展示SEQ_ID NO 62：揚氏梭菌丙酮酸：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶啟動子區之核酸序列。 圖51展示SEQ_ID NO 63：羅氏梭菌丙酮酸：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶啟動子區之核酸序列。 圖52展示確認具有質體pMTL85147-thlA-ctfAB-adc之自養性產乙醇梭菌中之異源基因thlA、ctfA、ctfB及adc的探針之擴增之qRT-PCR擴增曲線。 圖53展示確認具有質體pMTL85147-thlA-ctfAB-adc之揚氏梭菌中之異源基因thlA、ctfA、ctfB及adc的探針之擴增之qRT-PCR擴增曲線。 圖54展示SEQ_ID No.73：來自雷特氏乳球菌KFI47之α-酮基異戊酸去羧酶KivD之胺基酸序列，及SEQ_ID No.72：α-酮酸去羧酶(kivd)之核酸序列。 圖55展示Seq.ID No.76：α-酮酸去羧酶(kivd)之密碼子優化序列，SEQ_ID No.75：來自釀酒酵母之醇去氫酶Adh2之胺基酸序列及SEQ_ID No.74：醇去氫酶(adh2)之核酸序列。 圖56展示Seq.ID No.78：包括具有核糖體結合位點之間隔序列且側接NdeI及KpnI之密碼子優化α-酮酸去羧酶(kivd)及醇去氫酶(Adh2)之合成操縱子，及Seq.ID No.77：醇去氫酶(Adh2)之密碼子優化序列。 圖57展示SEQ_ID No.82：大腸桿菌-梭菌穿梭載體pMTL 85245之核酸序列，及SEQ_ID No.79：來自自養性產乙醇梭菌之磷酸轉乙醯酶乙酸激酶啟動子之核酸序列。 圖58展示SEQ_ID No.83：表現質體pMTL85245-kivd-adh2之核酸序列。 圖59展示SEQ_ID No.84：表現質體pMTL85245-kivd之核酸序列。 圖60展示SEQ_ID No.93：表現質體pMTL85245-P-thl-ctfAB-P-kivd之核酸序列。 圖61展示SEQ_ID No.98：表現質體pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-adh2之核酸序列。 圖62展示SEQ_ID No.101：表現質體pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-P-kivd-adh2之核酸序列。 圖63展示丙酮表現質體pMTL85245-kivd-adh2。 圖64展示丙酮表現質體pMTL85245-kivd。 圖65展示確認用自養性產乙醇梭菌DSM23693作為對照菌株(上圖)及自養性產乙醇梭菌DSM23693+pMTL85245-kivd-adh2(下圖)自含有CO之軋鋼廠氣體產生丙酮及異丙醇之GC結果。 圖66展示確認用自養性產乙醇梭菌DSM23693+pMTL85245-kivd自含有CO之軋鋼廠氣體產生丙酮及異丙醇之GC結果。 圖67展示丙酮表現質體pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc-P-kivd。 圖68展示丙酮表現質體pMTL83147-thlA-ctfA-ctfB-adc-adh。 圖69展示丙酮表現質體pMTL83147-thlA-ctfA-ctfB-adc-P-kivd-adh。 圖70展示確認用自養性產乙醇梭菌DSM23693(上圖)及自養性產乙醇梭菌DSM23693+pMTL85245-Pwl-thlA-ctfAB-kivd自含有CO之軋鋼廠氣體產生丙酮及異丙醇之GC結果。 圖71展示確認用自養性產乙醇梭菌DSM23693+pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-adh2自含有CO之軋鋼廠氣體產生丙酮及異丙醇之GC結果。 圖72展示確認用自養性產乙醇梭菌DSM23693+pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-P-kivd-adh2自含有CO之軋鋼廠氣體產生丙酮及異丙醇之GC結果。 圖73展示在大腸桿菌及自養性產乙醇梭菌中異源表現之梭菌路徑基因與來自雷特氏乳球菌之密碼子優化α-酮酸去羧酶Kivd及來自釀酒酵母之密碼子優化醇去氫酶Adh2的所測試基因組合。 圖74展示當在含有CO之軋鋼廠氣體作為基質之情況下，饋入自養性產乙醇梭菌DSM23693之穩定連續培養物中時，丙酮在高濃度及高速率下完全轉化成異丙醇。 <110> 紐西蘭商藍瑟科技紐西蘭有限公司<120> 重組微生物及其用途<130> 509018PCTPR <140> 101106425 <141> 2012/02/24 <150> US 61/446,832 <151> 2011-02-25 <160> 101 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 351 <212> PRT <213> 自養性產乙醇梭菌<400> 1 <210> 2 <211> 1056 <212> DNA <213> 自養性產乙醇梭菌<400> 2 <210> 3 <211> 1056 <212> DNA <213> 揚氏梭菌<400> 3 <210> 4 <211> 1056 <212> DNA <213> 羅氏梭菌<400> 4 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> 合成<400> 5 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> 合成引子<400> 6 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> 合成引子<400> 7 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> 合成引子<400> 8 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> 合成引子<400> 9 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> 合成引子<400> 10 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> 合成引子<400> 11 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> 合成引子<400> 12 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> 合成引子<400> 13 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> 合成引子<400> 14 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> 合成引子<400> 15 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> 合成引子<400> 16 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> 合成引子<400> 17 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> 合成引子<400> 18 <210> 19 <211> 654 <212> DNA <213> 拜氏梭菌<400> 19 <210> 20 <211> 666 <212> DNA <213> 拜氏梭菌<400> 20 <210> 21 <211> 741 <212> DNA <213> 拜氏梭菌<400> 21 <210> 22 <211> 558 <212> DNA <213> 自養性產乙醇梭菌<400> 22 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> 合成引子<400> 23 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> 合成引子<400> 24 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> 合成引子<400> 25 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> 合成引子<400> 26 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> 合成引子<400> 27 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> 合成引子<400> 28 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> 合成引子<400> 29 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> 合成引子<400> 30 <210> 31 <211> 15 <212> DNA <213> 合成引子<400> 31 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> 合成引子<400> 32 <210> 33 <211> 20<212> DNA <213> 合成引子<400> 33 <210> 34 <211> 601 <212> PRT <213> 合成蛋白質<400> 34 <210> 35 <211> 1806 <212> DNA <213> 合成基因<400> 35 <210> 36 <211> 37 <212> DNA <213> 合成引子<400> 36 <210> 37 <211> 37 <212> DNA <213> 合成引子<400> 37 <210> 38 <211> 351 <212> PRT <213> 拜氏梭菌<400> 38 <210> 39 <211> 1056 <212> DNA <213> 拜氏梭菌<400> 39 <210> 40 <211> 352 <212> PRT <213> 布氏嗜熱厭氧桿菌<400> 40 <210> 41 <211> 1056 <212> DNA <213> 布氏嗜熱厭氧桿菌<400> 41 <210> 42 <211> 392 <212> PRT <213> 丙酮丁醇梭菌<400> 42 <210> 43 <211> 217 <212> PRT <213> 拜氏梭菌<400> 43 <210> 44 <211> 221 <212> PRT <213> 拜氏梭菌<400> 44 <210> 45 <211> 246 <212> PRT <213> 拜氏梭菌<400> 45 <210> 46 <211> 6832 <212> DNA <213> 合成質體<400> 46<210> 47 <211> 2133 <212> DNA <213> 拜氏梭菌<400> 47 <210> 48 <211> 7922 <212> DNA <213> 合成質體<400> 48<210> 49 <211> 4709 <212> DNA <213> 合成質體<400> 49 <210> 50 <211> 128 <212> DNA <213> 大腸桿菌<400> 50 <210> 51 <211> 560 <212> DNA <213> 自養性產乙醇梭菌<400> 51 <210> 52 <211> 297 <212> DNA <213> 自養性產乙醇梭菌<400> 52 <210> 53 <211> 599 <212> DNA <213> 自養性產乙醇梭菌<400> 53 <210> 54 <211> 34 <212> DNA <213> 自養性產乙醇梭菌<400> 54 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> 自養性產乙醇梭菌<400> 55 <210> 56 <211> 560 <212> DNA <213> 揚氏梭菌<400> 56 <210> 57 <211> 557 <212> DNA <213> 羅氏梭菌<400> 57 <210> 58 <211> 536 <212> DNA <213> 揚氏梭菌<400> 58 <210> 59 <211> 549 <212> DNA <213> 羅氏梭菌<400> 59 <210> 60 <211> 298 <212> DNA <213> 揚氏梭菌<400> 60 <210> 61 <211> 300 <212> DNA <213> 羅氏梭菌<400> 61 <210> 62 <211> 590 <212> DNA <213> 揚氏梭菌<400> 62 <210> 63 <211> 600 <212> DNA <213> 羅氏梭菌<400> 63 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> 合成引子<400> 64 <210> 65 <211> 25 <212> DNA <213> 合成引子<400> 65 <210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> 合成引子<400> 66 <210> 67 <211> 25 <212> DNA <213> 合成引子<400> 67 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> 合成引子<400> 68 <210> 69 <211> 25 <212> DNA <213> 合成引子<400> 69 <210> 70 <211> 25 <212> DNA <213> 合成引子<400> 70 <210> 71 <211> 25 <212> DNA <213> 合成引子<400> 71 <210> 72 <211> 1647 <212> DNA <213> 雷特氏乳球菌<400> 72 <210> 73 <211> 548 <212> PRT <213> 雷特氏乳球菌<400> 73 <210> 74 <211> 2094 <212> DNA <213> 釀酒酵母<400> 74 <210> 75 <211> 348 <212> PRT <213> 釀酒酵母<400> 75 <210> 76 <211> 1650 <212> DNA <213> 雷特氏乳球菌<400> 76 <210> 77 <211> 1047 <212> DNA <213> 釀酒酵母<400> 77 <210> 78 <211> 2744 <212> DNA <213> 合成核酸<400> 78 <210> 79 <211> 479 <212> DNA <213> 自養性產乙醇梭菌<400> 79 <210> 80 <211> 28 <212> DNA <213> 合成引子<400> 80 <210> 81 <211> 28 <212> DNA <213> 合成引子<400> 81 <210> 82 <211> 3552 <212> DNA <213> 合成核酸<400> 82 <210> 83 <211> 6263 <212> DNA <213> 合成核酸<400> 83<210> 84 <211> 4630 <212> DNA <213> 合成核酸<400> 84 <210> 85 <211> 23 <212> DNA <213> 合成引子<400> 85 <210> 86 <211> 22 <212> DNA <213> 合成引子<400> 86 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> 合成引子<400> 87 <210> 88 <211> 36 <212> DNA <213> 合成引子<400> 88 <210> 89 <211> 27 <212> DNA <213> 合成引子<400> 89 <210> 90 <211> 27 <212> DNA <213> 合成引子<400> 90 <210> 91 <211> 27 <212> DNA <213> 合成引子<400> 91 <210> 92 <211> 43 <212> DNA <213> 合成引子<400> 92 <210> 93 <211> 38 <212> DNA <213> 合成引子<400> 93 <210> 94 <211> 43 <212> DNA <213> 合成引子<400> 94 <210> 95 <211> 7655 <212> DNA <213> 合成核酸<400> 95<210> 96 <211> 35 <212> DNA <213> 合成引子<400> 96 <210> 97 <211> 39 <212> DNA <213> 合成引子<400> 97 <210> 98 <211> 8621 <212> DNA <213> 合成核酸<400> 98 <210> 99 <211> 37 <212> DNA <213> 合成引子<400> 99 <210> 100 <211> 39 <212> DNA <213> 合成引子<400> 100 <210> 101 <211> 10803 <212> DNA <213> 合成核酸<400> 101
权利要求:
Claims (78) [1] 一種重組一氧化碳營養性產乙酸微生物，其能夠藉由使包含CO之基質進行醱酵，產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體。 [2] 如請求項1之微生物，其中該微生物適於表現以下一或多者：a.異丙醇生物合成路徑中之一或多種非天然存在於產生該重組微生物之親本微生物中的酶；b.丙酮生物合成路徑中之一或多種非天然存在於產生該重組微生物之親本微生物中的酶。 [3] 如請求項1之微生物，其中該微生物適於過度表現以下一或多者：a.異丙醇生物合成路徑中之一或多種天然存在於產生該重組微生物之親本微生物中的酶；b.丙酮生物合成路徑中之一或多種天然存在於產生該重組微生物之親本微生物中的酶。 [4] 如請求項1至3中任一項之微生物，其中該微生物適於：a.表現與丙酮轉化成異丙醇有關之一或多種非天然存在於產生該重組微生物之親本微生物中的酶；及/或b.過度表現與丙酮轉化成異丙醇有關之一或多種天然存在於產生該重組微生物之親本微生物中的酶。 [5] 如請求項1至4中任一項之微生物，其中該親本微生物能夠使包含CO之基質醱酵以產生丙酮，但不能將丙酮轉化成異丙醇且該重組微生物適於表現與丙酮轉化成異丙醇有關之一或多種酶。 [6] 如請求項1至4中任一項之微生物，其中該親本微生物能夠將丙酮轉化成異丙醇，但不能使包含CO之基質醱酵以產生丙酮，且該重組微生物適於表現丙酮生物合成路徑中之一或多種酶。 [7] 如請求項1至4中任一項之微生物，其中該親本微生物不能使包含CO之基質醱酵以產生丙酮及異丙醇，且該重組微生物適於表現丙酮生物合成路徑中之一或多種酶及與丙酮轉化成異丙醇有關之一或多種酶。 [8] 如請求項1至7中任一項之微生物，其中異丙醇及/或丙酮生物合成路徑中之該一或多種酶係選自由以下組成之群：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)；乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA；EC 2.8.3.9)；乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)；乙醯乙酸去羧酶(Adc；EC 4.1.1.4)；α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD；EC4.1.1.74)；及其任何一或多者之功能等效變異體。 [9] 如請求項8之微生物，其中該乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)為源於丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)之乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶。 [10] 如請求項8之微生物，其中該等酶乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)及乙醯乙酸去羧酶(Adc)源於拜氏梭菌(C.beijerinckii)。 [11] 如請求項8之微生物，其中該α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)源於雷特氏乳球菌(Lactococcus lactis)。 [12] 如請求項1至11中任一項之微生物，其中該一或多種與丙酮轉化成異丙醇有關之酶係選自由以下組成之群：醇去氫酶(Adh；EC 1.1.1.2)；醇去氫酶(Adh2；EC 1.1.1.1)；及其功能等效變異體。 [13] 如請求項12之微生物，其中該醇去氫酶(Adh)源於自養性產乙醇梭菌(C.autoethanogenum)、揚氏梭菌(C.ljungdahlii)及/或羅氏梭菌(C.ragsdalei)。 [14] 如請求項12之微生物，其中醇去氫酶(Adh2)源於釀酒酵母(S.cerevisiae)。 [15] 如請求項13之微生物，其中該醇去氫酶具有胺基酸序列SEQ_ID NO.1，或其為該胺基酸序列之功能等效變異體。 [16] 如請求項15之微生物，其中該功能等效變異體與SEQ_ID NO.1具有至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。 [17] 如請求項1至16中任一項之微生物，其中該微生物包含一或多種適於增加該親本微生物之一或多種天然核酸之表現的外源性核酸且該一或多種核酸編碼丙酮生物合成路徑及/或異丙醇生物合成路徑中之一或多種酶。 [18] 如請求項17之微生物，其中該一或多種適於增加表現之外源性核酸為調控元件。 [19] 如請求項1至18中任一項之微生物，其中該微生物包含一或多種編碼且適於表現丙酮生物合成路徑及/或異丙醇生物合成路徑中之一或多種酶的外源性核酸。 [20] 如請求項19之微生物，其中該微生物包含一或多種編碼且適於表現該等酶中之至少兩者的外源性核酸。 [21] 如請求項19之微生物，其中該微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA；EC 2.8.3.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)及乙醯乙酸去羧酶(Adc；EC 4.1.1.4)或其任何一或多者之功能等效變異體。 [22] 如請求項19至21中任一項之微生物，其中該微生物包含一或多種編碼醇去氫酶(Adh；EC 1.1.1.2)或其功能等效變異體之外源性核酸。 [23] 如請求項19之微生物，其中該微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD；EC4.1.1.74)及醇去氫酶(Adh2；EC 1.1.1.1)，或其任何一或多者之功能等效變異體。 [24] 如請求項19之微生物，其中該微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA；EC 2.8.3.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)及α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD；EC4.1.1.74)，或其任何一或多者之功能等效變異體。 [25] 如請求項19之微生物，其中該微生物包含一或多種編碼α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD；EC4.1.1.74)或其功能等效變異體之外源性核酸。 [26] 如請求項19之微生物，其中該微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA；EC 2.8.3.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)、乙醯乙酸去羧酶(Adc；EC 4.1.1.4)及醇去氫酶(Adh2；EC 1.1.1.1)，或其任何一或多者之功能等效變異體。 [27] 如請求項19之微生物，其中該微生物包含一或多種編碼以下每一者之外源性核酸：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA；EC 2.8.3.9)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB；EC 2.8.3.9)、乙醯乙酸去羧酶(Adc；EC 4.1.1.4)、α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD；EC4.1.1.74)及醇去氫酶(Adh2；EC 1.1.1.1)，或其任何一或多者之功能等效變異體。 [28] 如請求項22之微生物，其中該編碼醇去氫酶(Adh)之核酸包含序列SEQ_ID NO.2、SEQ_ID NO.3或SEQ_ID NO.4或其任一種功能等效變異體。 [29] 如請求項28之微生物，其中該編碼醇去氫酶之核酸之該功能等效物與SEQ_ID NO.2、3或4具有至少約83%序列一致性。 [30] 如請求項20至29中任一項之微生物，其中該外源性核酸為具有核苷酸序列SEQ_ID No.46、48、81、82、93、96或99之表現質體。 [31] 如請求項1至30中任一項之微生物，其中該親本微生物係選自下列各物所組成群中之一氧化碳營養性產乙酸細菌群：自養性產乙醇梭菌、揚氏梭菌、羅氏梭菌、梭菌(Clostridium carboxidivorans)、黑暗梭菌(Clostridium drakei)、糞味梭菌(Clostridium scatologenes)、黏丁酸桿菌(Butyribacterium limosum)、甲基營養性丁酸桿菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏乙酸桿菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜鹼菌(Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、淤泥真桿菌(Eubacterium limosum)、嗜熱乙酸穆爾氏菌(Moorella thermoacetica)、嗜熱自養性穆爾氏菌(Moorella thermautotrophica)、芬氏產乙酸桿菌(Oxobacter pfennigii)及凱氏嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。 [32] 如請求項31之微生物，其中該親本微生物為自養性產乙醇梭菌或揚氏梭菌。 [33] 如請求項32之微生物，其中該微生物為自養性產乙醇梭菌DSM23693或揚氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。 [34] 如請求項1至33中任一項之微生物，其中該親本微生物缺乏編碼ThlA、CtfA、CtfB、Adc、KivD、Adh2及Adh之一或多種基因。 [35] 如請求項34之微生物，其中該親本微生物缺乏編碼Adh之基因。 [36] 如請求項34之微生物，其中該親本微生物缺乏編碼ThlA、CtfA、CtfB、Adc及KivD之基因中之每一者。 [37] 一種醇去氫酶(Adh)，其具有胺基酸序列SEQ_ID NO.1或其任一種功能等效變異體。 [38] 如請求項37之醇去氫酶(Adh)，其中該功能等效變異體與SEQ_ID NO.1具有至少約88%序列一致性。 [39] 一種核酸，其編碼具有SEQ_ID NO.1之Adh或其功能等效變異體。 [40] 一種核酸，其具有選自由以下組成之群之序列：SEQ_ID NO.2；SEQ_ID NO.3；SEQ_ID NO.4；及其任一種功能等效變異體。 [41] 如請求項40之核酸，其中該功能等效變異體為與SEQ_ID NO.2、3或4具有至少約83%序列一致性之核酸。 [42] 一種核酸，其能夠與核酸SEQ_ID NO.2、3或4、核酸SEQ_ID NO.2、3或4之互補核酸或其任一者之功能等效變異體中至少一部分雜交。 [43] 一種核酸，其選自由以下組成之群：SEQ_ID NO.5；SEQ_ID NO.6；SEQ_ID NO.7；SEQ_ID NO.8；SEQ_ID NO.9；SEQ_ID NO.10；SEQ_ID NO.11；SEQ_ID NO.12；SEQ_ID NO.13；SEQ_ID NO.14；SEQ_ID NO.15；SEQ_ID NO.16；SEQ_ID NO.17；SEQ_ID NO.18；SEQ_ID NO.23；SEQ_ID NO.24；SEQ_ID NO.25；SEQ_ID NO.26；SEQ_ID NO.27；SEQ_ID NO.28；SEQ_ID NO.29；SEQ_ID NO.30；SEQ_ID NO.31；SEQ_ID NO.32；SEQ_ID NO.33；SEQ_ID NO.64；SEQ_ID NO.65；SEQ_ID NO.66；SEQ_ID NO.67；SEQ_ID NO.68；SEQ_ID NO.69；SEQ_ID NO.70；SEQ_ID NO.71；SEQ_ID NO.85；SEQ_ID NO.86；SEQ_ID NO.87；SEQ_ID NO.88；SEQ_ID NO.89；SEQ_ID NO.90；SEQ_ID NO.91；SEQ_ID NO.92；SEQ_ID NO.93；SEQ_ID NO.94；SEQ_ID NO.96；SEQ_ID NO.97；SEQ_ID NO.99；SEQ_ID NO.100。 [44] 一種其編碼一或多種酶之核酸，當其在微生物中表現時，會允許該微生物藉由使包含CO之基質進行醱酵，來產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體。 [45] 如請求項44之核酸，其中該核酸編碼兩種或兩種以上的酶，當其在微生物中表現時，會允許該微生物藉由使包含CO之基質進行醱酵來產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體。 [46] 如請求項45或46之核酸，其中該等酶係選自乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)、乙醯乙酸去羧酶(Adc)、α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)、醇去氫酶(Adh)、醇去氫酶(Adh2)及其任何一或多者之功能等效變異體。 [47] 如請求項44至46中任一項之核酸，其中該核酸依任何順序包含編碼以下每一者之核酸序列：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)及乙醯乙酸去羧酶(Adc)或其任何一或多者之功能等效變異體。 [48] 如請求項44至47中任一項之核酸，其中該核酸包含編碼醇去氫酶(Adh)或其功能等效變異體之核酸序列。 [49] 如請求項44至46中任一項之核酸，其中該核酸依任何順序包含編碼以下每一者之核酸序列：α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)、醇去氫酶(Adh2)或其任何一或多者之功能等效變異體。 [50] 如請求項44至46中任一項之核酸，其中該核酸依任何順序包含編碼以下每一者之核酸序列：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)、α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)，或其任何一或多者之功能等效變異體。 [51] 如請求項44至46中任一項之核酸，其中該核酸包含編碼α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)或其功能等效變異體之核酸序列。 [52] 如請求項44至46中任一項之核酸，其中該核酸依任何順序包含編碼以下每一者之核酸序列：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)、乙醯乙酸去羧酶(Adc)、醇去氫酶(Adh2)，或其任何一或多者之功能等效變異體。 [53] 如請求項44至46中任一項之核酸，其中該核酸依任何順序包含編碼以下每一者之核酸序列：乙醯基-輔酶A乙醯基轉移酶(硫解酶；ThlA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶A(CoA轉移酶；CtfA)、乙醯乙醯基-CoA：乙酸輔酶A轉移酶B(CoA轉移酶；CtfB)、乙醯乙酸去羧酶(Adc)、α-酮基異戊酸去羧酶(去羧酶；KivD)、醇去氫酶(Adh2)，及其任何一或多者之功能等效變異體。 [54] 如請求項47之核酸，其中該核酸包含編碼具有序列SEQ_ID NO.1之醇去氫酶(Adh)或其功能等效變異體之核酸序列。 [55] 如請求項46至48中任一項之核酸，其中該醇去氫酶(Adh)之功能等效變異體與SEQ_ID NO.1具有至少約88%序列一致性。 [56] 如請求項46至48中任一項之核酸，其中該編碼醇去氫酶(Adh)之核酸序列包含SEQ_ID NO.2、SEQ_ID NO.3或SEQ_ID NO.4或為其任一種功能等效變異體。 [57] 如請求項56之核酸，其中該功能等效變異體與SEQ_ID NO.2、3或4具有至少約83%序列一致性。 [58] 一種核酸構築體或載體，其包含如請求項44至57中任一項之核酸。 [59] 如請求項58之構築體或載體，其中該構築體或載體為表現構築體。 [60] 如請求項59之構築體或載體，其中該構築體或載體具有核苷酸序列SEQ_ID No.46、47、48、83、84、95、98或101。 [61] 一種宿主生物體，其包含如請求項44至57之核酸或如請求項58至60中任一項之載體或構築體中的任何一或多者。 [62] 一種組合物，其包含如請求項58至61中任一項之構築體或載體及甲基化構築體或載體。 [63] 一種產生如請求項1至36中任一項之重組微生物之方法，其包含：a.將(i)如請求項59或60之構築體/載體及(ii)包含甲基轉移酶基因之甲基化構築體/載體引入穿梭微生物中；b.表現該甲基轉移酶基因；c.自該穿梭微生物分離該一或多種構築體/載體；及d.將至少該表現構築體/載體引入目標微生物中。 [64] 一種產生如請求項1至36中任一項之重組微生物之方法，其包括：a.在活體外藉由甲基轉移酶使如請求項59或60之表現構築體/載體甲基化；b.將該表現構築體/載體引入目標微生物中。 [65] 一種產生如請求項1至36中任一項之重組微生物之方法，其包括：a.將甲基轉移酶基因引入穿梭微生物之基因組中；b.將如請求項59或60之表現構築體/載體引入該穿梭微生物中；c.自該穿梭微生物分離一或多種構築體/載體；及d.將至少該表現構築體/載體引入目標微生物中。 [66] 一種藉由微生物醱酵來產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體之方法，其包括使用如請求項1至36中任一項之重組微生物來使包含CO之基質進行醱酵。 [67] 如請求項66之方法，其中該方法包括以下步驟：(a)向含有一或多種微生物之培養物的生物反應器提供包含CO之基質；及(b)在該生物反應器中使該培養物厭氧醱酵，以產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體。 [68] 如請求項66之方法，其中該方法包括以下步驟：a.在工業過程所產生含有CO之氣體釋入大氣中之前先捕捉該氣體；b.藉由含有一或多種微生物之培養物利用該含有CO之氣體進行厭氧醱酵，以產生丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體。 [69] 如請求項66至68中任一項之方法，其中該包含CO之基質為包含CO之氣體基質。 [70] 如請求項69之方法，其中該基質包含工業廢氣。 [71] 如請求項70之方法，其中該氣體為軋鋼廠廢氣或合成氣。 [72] 如請求項66至71中任一項之方法，其中該基質包含至少約20體積%至約100體積% CO。 [73] 如請求項66至72中任一項之方法，其中該方法另外包括回收丙酮、異丙醇及/或丙酮及/或異丙醇之前驅體中之一或多者之步驟。 [74] 一種丙酮、異丙醇及丙酮及/或異丙醇之前驅體，其係藉由如請求項66至73中任一項之方法產生。 [75] 一種能夠產生丙酮且包含一或多種編碼一或多種適於將乙醯乙酸轉化成丙酮之酶之外源性核酸的重組微生物，其中該重組微生物源於能夠產生乙醯乳酸而非丙酮之親本微生物。 [76] 如請求項75之重組微生物，其中該一或多種酶包含KivD或其功能等效變異體。 [77] 一種能夠產生丙酮且包含一或多種編碼酶thlA、ctfA、ctfB及kivD或其任何一或多者之功能等效變異體中之每一者之外源性核酸的重組微生物，其中該重組微生物源於不能產生乙醯乳酸、乙醯乙醯基-CoA及丙酮之親本微生物。 [78] 一種能夠產生丙酮且包含一或多種編碼酶ctfA、ctfB及kivD或其任何一或多者之功能等效變異體中之每一者之外源性核酸的重組微生物，其中該重組微生物源於不能產生乙醯乳酸及丙酮之親本微生物。
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公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题 US5173429A|1990-11-09|1992-12-22|The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas|Clostridiumm ljungdahlii, an anaerobic ethanol and acetate producing microorganism| US5593886A|1992-10-30|1997-01-14|Gaddy; James L.|Clostridium stain which produces acetic acid from waste gases| AR023046A1|1998-09-08|2002-09-04|Bioengineering Resources Inc|UNA MEZCLA COSOLVENTE/SOLVENTE INMISCIBLE CON AGUA; PROCESO DE OBTENCIoN DE ÁCIDO ACÉTICO Y DE FERMENTACIoN MICROBIANA Y SOLVENTES MODIFICADOS PARA LA EXTRACIoN DE ACIDO ACÉTICO| EA006106B1|2000-07-25|2005-08-25|Эммаус Фаундейшн, Инк.|Способ стабильной непрерывной выработки этанола| EP1948814B1|2005-10-26|2018-11-21|Butamax Advanced Biofuels LLC|Fermentive production of four carbon alcohols| NZ546496A|2006-04-07|2008-09-26|Lanzatech New Zealand Ltd|Gas treatment process| US7704723B2|2006-08-31|2010-04-27|The Board Of Regents For Oklahoma State University|Isolation and characterization of novel clostridial species| EP2217696B1|2007-11-13|2015-09-16|Lanzatech New Zealand Limited|Novel bacteria and methods of use thereof| CA2718219C|2008-03-12|2013-01-08|Lanzatech New Zealand Limited|Microbial alcohol production process| US8216820B2|2008-04-25|2012-07-10|Research Institute Of Innovative Technology For The Earth|Transformant of coryneform bacteria capable of producing isopropanol| WO2010071697A1|2008-12-16|2010-06-24|Genomatica, Inc.|Microorganisms and methods for conversion of syngas and other carbon sources to useful products| DE102009002583A1|2009-04-23|2010-10-28|Evonik Degussa Gmbh|Zellen und Verfahren zur Herstellung von Aceton| NZ598374A|2009-08-21|2014-10-31|Mascoma Corp|Production of propanols, alcohols, and polyols in consolidated bioprocessing organisms| US8143037B2|2010-03-19|2012-03-27|Coskata, Inc.|Ethanologenic Clostridium species, Clostridium coskatii |NZ700609A|2012-04-05|2016-07-29|Lanzatech New Zealand Ltd|Enzyme-altered metabolite activity| US20130316364A1|2012-05-23|2013-11-28|Lanzatech New Zealand Limited|Selection Method and Recombinant Microorganisms and uses Therefor| EP2855690B1|2012-05-30|2018-07-11|Lanzatech New Zealand Limited|Recombinant microorganisms and their uses| US20130323820A1|2012-06-01|2013-12-05|Lanzatech New Zealand Limited|Recombinant microorganisms and uses therefor| KR102079275B1|2012-06-08|2020-02-19|란자테크 뉴질랜드 리미티드|재조합 미생물 및 그에 대한 용도| US9347076B2|2012-06-21|2016-05-24|Lanzatech New Zealand Limited|Recombinant microorganisms that make biodiesel| CN105283554A|2013-06-05|2016-01-27|朗泽科技新西兰有限公司|表现出提高的通过发酵途径的通量的重组微生物| KR102324599B1|2013-09-22|2021-11-12|란자테크 뉴질랜드 리미티드|발효 공정| WO2015085015A1|2013-12-03|2015-06-11|Lanzatech New Zealand Limited|Microorganisms and methods for the production of ketones| WO2015116734A1|2014-01-28|2015-08-06|Lanzatech New Zealand Limited|Method of producing a recombinant microorganism| EP3210012A4|2014-10-22|2018-05-23|Lanzatech New Zealand Limited|Gas testing unit and method| EP3209786A4|2014-10-22|2018-06-06|Lanzatech New Zealand Limited|Multi-stage bioreactor processes| HUE052810T2|2014-12-08|2021-05-28|Lanzatech New Zealand Ltd|Rekombináns mikroorganizmusok, amelyek megnövekedett fluxust mutatnak fermetációs útvonalon keresztül| WO2016138050A1|2015-02-23|2016-09-01|Lanzatech New Zealand Limited|Recombinant acetogenic bacterium for the conversion of methane to products| JP6905518B2|2015-10-13|2021-07-21|ランザテク・ニュージーランド・リミテッド|エネルギー発生発酵経路を含む遺伝子操作細菌| WO2017096324A1|2015-12-03|2017-06-08|Lanzatech New Zealand Limited|Arginine supplementation to improve efficiency in gas fermenting acetogens| US10358661B2|2015-12-28|2019-07-23|Lanzatech New Zealand Limited|Microorganism with modified hydrogenase activity| JP6896748B2|2016-02-01|2021-06-30|ランザテク・ニュージーランド・リミテッド|統合型発酵電解プロセス| KR20180110144A|2016-02-26|2018-10-08|란자테크 뉴질랜드 리미티드|C1-고정 박테리아에 대한 crispr/cas 시스템| CA3024114C|2016-05-14|2020-02-04|Lanzatech, Inc.|Microorganism with modified aldehyde:ferredoxin oxidoreductase activity and related methods| AU2018329846A1|2017-09-08|2020-03-19|Lanzatech, Inc.|Processes and systems for metabolite production using hydrogen rich C1-containing substrates| US11097967B2|2018-11-19|2021-08-24|Lanzatech, Inc.|Integration of fermentation and gasification| EA202191899A1|2019-02-08|2021-10-19|Ланцатек, Инк.|Способ извлечения продуктов с близкими температурами кипения| EP3942058A1|2019-03-20|2022-01-26|Global Bioenergies|Improved means and methods for producing isobutene from acetyl-coa| CN111057686B|2019-12-23|2021-05-04|浙江大学|一种醇脱氢酶突变体及应用|
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申请号 | 申请日 | 专利标题 US201161446832P| true| 2011-02-25|2011-02-25|| 相关专利
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